[发明专利]一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法及其应用。具体而言，该方法包括对于慢病毒载体上的WPRE、HIV‑1Ψ和RRE元件中的至少一种进行检测。经研究发现，通过对慢病毒载体上的上述元件进行检测，能够稳定且有效地检测出整合入CAR‑T细胞基因组中整合的慢病毒载体拷贝数，且不受CART靶点和技术更新换代的限制，具有检测通用性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法及其应用。

背景技术

随着生物技术的发展，基因治疗已成为治疗感染性疾病、遗传疾病、神经系统疾病以及肿瘤的焦点。用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体。目前，常用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒载体四大系统，其中腺病毒与腺相关病毒不能将外源基因整合到基因组中，且外源基因表达时间比较短；而逆转录病毒和慢病毒能够随机将外源基因整合到细胞的基因组中，实现外源基因的长久持续性表达。

与逆转录病毒比较而言，慢病毒载体因为载体容量高、病毒滴度高、不受细胞分裂时期限制且无被基因沉默的风险，在临床上常常作为疾病的治疗工具。

慢病毒包装系统是以慢病毒基因组为基础，人为去除病毒复制所需要的基因，同时，插入用于基因表达、敲除或沉默的元件构建而成。目前，常用的为二代和三代慢病毒包装系统，主要由包装质粒、包膜质粒和穿梭质粒构成，将这些质粒共转染到293T细胞中，最后能够获得具有复制缺陷的慢病毒，以用于转染其他细胞。

CAR-T疗法为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，其是通过将分离病人的T淋巴细胞在体外进行基因改造，将肿瘤相关抗原(TAA)的结合区与T细胞胞内信号激活区4-1BB或CD28及其CD3-ζ链形成的嵌合基因表达在T细胞的表面，使病人的T细胞获得识别癌细胞抗原的能力，经过体外扩大培养之后，回输到病人体内从而达到清除癌细胞的一种免疫疗法。

近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得了很好的效果。而CART的制备与质控是影响CART治疗临床疗效和安全性的关键因素，2018年6月5日中国食品药品鉴定所研究院颁发《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》第六章第3节明确将CAR-T细胞基因组中慢病毒载体拷贝数及整合的检测作为质控的标准。

目前，慢病毒载体拷贝数检测设计的引物和探针主要是针对CAR结构的scFv区、CD28-CD3区和CD137-CD3区，然而针对scFv区的引物和探针会因不同CAR产品类型而缺乏通用性；针对CD28-CD3区和CD137-CD3区的引物和探针会因为CAR产品的代次更新缺乏通用性；同时，针对CD28-CD3区和CD137-CD3区的引物和探针含有较多人源性基因的序列，扩增片段的特异性也会受到很大影响。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法及其应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，实施例提供了一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法，其包括：检测来自慢病毒载体上的基因元件；所述基因元件选自WPRE、HIV-1Ψ和RRE中的至少一种。

第二方面，实施例还提供了一种用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂，其包括用于检测来自慢病毒载体上的基因元件的试剂；所述基因元件选自WPRE、HIV-1Ψ和RRE中的至少一种。

第三方面，实施例还提供了一种用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂盒，其包括如前述实施例所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂。

第四方面，实施例还提供了前述实施例所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂在检测慢病毒载体拷贝数中的应用。