[发明专利]一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法及其应用

权利要求书

1.一种用于检测慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，其包括：检测来自慢病毒载体上的基因元件；所述基因元件选自WPRE、HIV-1Ψ和RRE中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述基因元件的检测方式为：将能够扩增所述基因元件的引物组与提取自目标CAR-T细胞的待测核酸样本混合以进行PCR扩增；

优选地，所述待测核酸样本为DNA样本。

3.根据权利要求2所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，当所述基因元件为WPRE元件时，所述引物组包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对和/或序列如SEQID No.3所示的探针，或者所述引物组包括序列如SEQ ID No.4～5所示的引物对和/或序列如SEQ ID No.6所示的探针；

当所述基因元件为HIV-1Ψ元件时，所述引物组包括序列如SEQ ID No.7～8所示的引物对和/或SEQ ID No.9所示的探针；

当所述基因元件为RRE元件时，所述引物组包括序列如SEQ ID No.10～11所示的引物对和/或序列如SEQ ID No.12所示的探针，或者所述引物组包括序列如SEQ ID No.13～14所示的引物对和/或序列如SEQ ID No.15所示的探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，所述引物组中的探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

优选地，所述荧光基团选自：VIC、FAM、TET、HEX、CY3、CY5、Texas Red、LC RED640和LCRED705中的任意一种；

优选地，所述淬灭基团选自：BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系：10×Taq2.4～2.6μl，24～26mM dNTP 0.1～0.3μl，9～11μM上游引物0.4～0.6μl，9～11μM下游引物0.4～0.6μl，19～21μM探针0.1～0.3μl，4～6U/μl Taq7 DNA聚合酶0.15～0.35μl，90～110mM Mg²⁺4～6μl，待扩增DNA模板18～22ng，补足ddH₂O至25μl；

PCR扩增的反应条件：95℃，10min；(94℃，15s；55℃，40s；)×45。

6.一种用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂，其特征在于，其包括用于检测来自慢病毒载体上的基因元件的试剂；所述基因元件选自WPRE、HIV-1Ψ和RRE中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂，其特征在于，当所述基因元件为WPRE元件时，所述试剂包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对和/或序列如SEQID No.3所示的探针，或者所述试剂包括序列如SEQ ID No.4～5所示的引物对和/或序列如SEQ ID No.6所示的探针；

当所述基因元件为HIV-1Ψ元件时，所述试剂包括序列如SEQ ID No.7～8所示的引物对和/或SEQ ID No.9所示的探针；

当所述基因元件为RRE元件时，所述试剂包括序列如SEQ ID No.10～11所示的引物对和/或序列如SEQ ID No.12所示的探针，或者所述试剂包括序列如SEQ ID No.13～14所示的引物对和/或序列如SEQ ID No.15所示的探针。

8.一种用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求6或7所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂。

9.如权利要求6或7所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂在检测慢病毒载体拷贝数中的应用；

优选地，所述慢病毒载体拷贝数为整合入CAR-T细胞基因组中的慢病毒载体拷贝数。

10.如权利要求6或7所述的用于检测慢病毒载体拷贝数的试剂在检测待测样本中CAR拷贝数的应用。