[发明专利]鸡源致病性细菌多重PCR检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及鸡源致病性细菌多重PCR检测方法及检测试剂盒。本发明选择巴氏杆菌中特异性基因kmt1，沙门氏菌的主要毒力因子inv A，大肠杆菌的持家基因pho A作为靶序列，应用Primer Premier5.0分别设计3对特异性引物。本发明的方法可以快速检测并鉴别禽巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌，具有特异性好、敏感度高，能为3种细菌感染的流行病学调查、快速确诊和有效防控提供技术支持。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及鸡源致病性细菌多重PCR 检测方法及检测试剂盒。

背景技术

巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、大肠杆菌 (Escherichiacoli)和沙门氏菌(Salmonella enteriditis)均是严重危害养鸡业的常见病原菌，感染鸡群后的临床症状相似，且发生混合感染的情况日趋严重，常导致较高发病率和死亡，阻碍了养禽业的健康发展。

目前细菌混合感染的临床鉴别诊断主要依靠传统的细菌分离鉴定和细菌16S rRNA的单一PCR扩增及产物测序比对，存在操作繁琐、检测周期长、灵敏度低等问题。

因此，建立一种能同时鉴别鸡群多种致病菌混合感染的多重PCR (Multiplexpolymerase chain reaction，MPCR)方法是目前的重点研究方向，其不仅具有普通PCR的高特异性和敏感性等优点，还能同时扩增多个基因片段，快速准确，可用于多种病原的鉴定或同种病原多个基因的检测。如专利CN106701976A(一种鸡常见细菌病的病原多重PCR检测试剂盒)，其是针对多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行多重检测，但是其检测下限为0.01ng/μL，准确率为92.6％，尚有较大不足。

因此，寻找一种能同时鉴别巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和沙门氏菌(Salmonella enteriditis) 三种病原菌的快速便捷，并且特异性好、敏感度高的检测方法及检测试剂盒，是当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供鸡源致病性细菌多重PCR检测方法及检测试剂盒，具体是通过以下技术方案得以实现的：

鸡源致病性细菌多重PCR检测方法，使用了以下引物：

大肠杆菌上引物：5'CGTTTCTACCGCAGAGTTG 3'

大肠杆菌下引物：5'GTCATCTGTGCCAGGGTC 3'

沙门氏菌上引物：5'GCTCTTTCGTCTGGCATTA 3'

沙门氏菌下引物：5'CAATACTCATCTGTTTACCG 3'

巴氏杆菌上引物：5'GAATCAAGCGGTCACAGA 3'

巴氏杆菌下引物：5'CCCACCACATCAAATCCC 3'

优选的，所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)DNA模板制备：对样品的基因组DNA进行提取，然后取3μL DNA作为待测样品，作为多重PCR的模板；

(2)建立50μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25μL，待测样品3μL，3对引物的上、下游引物各2μL，dd H₂O 10μL， 3对引物的浓度为0.5-2μmol/L，退火温度为51-57℃；

(3)反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火 30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃反应结束；