[发明专利]鸡源致病性细菌多重PCR检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.鸡源致病性细菌多重PCR检测方法，其特征在于，使用了以下引物：

大肠杆菌上引物：5'CGTTTCTACCGCAGAGTTG 3'

大肠杆菌下引物：5'GTCATCTGTGCCAGGGTC 3'

沙门氏菌上引物：5'GCTCTTTCGTCTGGCATTA 3'

沙门氏菌下引物：5'CAATACTCATCTGTTTACCG 3'

巴氏杆菌上引物：5'GAATCAAGCGGTCACAGA 3'

巴氏杆菌下引物：5'CCCACCACATCAAATCCC 3'

2.根据权利要求1所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)DNA模板制备：对样品的基因组DNA进行提取，然后取3μL DNA作为待测样品，作为多重PCR的模板；

(2)建立50μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25μL，待测样品3μL，3对引物的上、下游引物各2μL，dd H₂O 10μL，3对引物的浓度为0.5-2μmol/L，退火温度为51-57℃；

(3)反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃反应结束；

(4)PCR产物鉴定：PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析；

(5)观察结果：观察474bp、242bp、667bp处是否有出现相应的目的条带，474bp处出现目标条带说明有大肠杆菌，242bp处出现目标条带说明有沙门氏菌，667bp处出现目标条带说明有巴氏杆菌。

3.鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下引物：

大肠杆菌上引物：5'CGTTTCTACCGCAGAGTTG 3'

大肠杆菌下引物：5'GTCATCTGTGCCAGGGTC 3'

沙门氏菌上引物：5'GCTCTTTCGTCTGGCATTA 3'

沙门氏菌下引物：5'CAATACTCATCTGTTTACCG 3'

巴氏杆菌上引物：5'GAATCAAGCGGTCACAGA 3'

巴氏杆菌下引物：5'CCCACCACATCAAATCCC 3'

4.根据权利要求3所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Ⅰ液，所述Ⅰ液为40μL混合引物。

5.根据权利要求3所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Ⅱ液，所述Ⅱ液为250μL PCR反应混合液。

6.根据权利要求5所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液，其中各成分浓度为：Taq DNA聚合酶0.2U/μL，氯化镁5mmol/μL，dNTP100pmol/μL。

7.根据权利要求3所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阴性对照，所述阴性对照为20μL超纯水。

8.根据权利要求3所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照，所述阳性对照为大肠杆菌Pho A基因序列、沙门菌inv A基因序列、巴氏杆菌kmt1基因序列的克隆质粒。

9.根据权利要求3所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应体系为50μL反应体系，具体为：2×Taq PCR Master Mix 25μL，待测样品3μL，3对引物的上、下游引物各2μL，dd H₂O 10μL，3对引物的浓度为0.5-2μmol/L，退火温度为51-57℃。

10.根据权利要求3所述的鸡源致病性细菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸10min，4℃反应结束。