[发明专利]一种鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的SSR引物及方法

权利要求书

1.一种利用SSR引物鉴定云萝卜2号杂交种子纯度的方法，其特征在于，所述SSR引物为SSR06，包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2；

所示所述方法包括：

步骤1，采用CTAB法提取云萝卜2号父本材料WR01、母本材料WS01，杂交种F₁的叶片基因组DNA；

步骤2，以步骤1所提取的云萝卜2号杂交种基因组DNA作为模板，采用所述SSR引物SSR06进行PCR扩增；

步骤3，将步骤2中的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果；比较云萝卜2号杂交种及其双亲的特征谱带，表现共显性互补带型为云萝卜2号杂交种，只有亲本带型的为非杂交种，出现其他第三种带型的为外来杂种;

步骤4，利用步骤3的统计结果计算云萝卜2号杂交种的纯度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3扩增产物的检测包括：

步骤i，将步骤2的扩增产物中加入2 µL上样缓冲液，经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每个样孔点2 μL，DL50 DNA Marker 为对照，恒压下电泳一段时间；

步骤ii，电泳结束后，将凝胶剥下在固定液中浸泡一段时间后取出用双氧水冲洗一次，在0.1% AgNO₃溶液中银染一段时间后取出用双氧水快速冲洗数次，随后浸泡在于显影液进行显影，直至可以观察到DNA条带；

步骤iii，立即用双氧水漂洗，平铺放在观察灯上统计带型并拍照编号保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述云萝卜2号杂交种的纯度是通过以下方式进行计算的：

送检测云萝卜2号纯度（%）=（总检测种子粒数-非杂交种数-外来杂交种数）/总检测种子粒数×100%。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增时，反应体系包括: 10 µL 2×Taq plus master mixII，7 µL ddH20，1 µL模板DNA ，上游引物SSR06-F和下游引物SSR06-R各1 µL。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR扩增时的PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min ；30个扩增循环，95 ℃ 变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸1 min 25 s；72 ℃延伸 5 min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中提取云萝卜2号父本材料WR01、母本材料WS01，杂交种F₁的叶片基因组DNA的步骤包括：

步骤a，取幼嫩叶片放入离心管中，加入液氮用研磨棒研磨，加CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至一定体积，水浴；

步骤b，加入V氯仿：V异戊醇=24:1，轻摇，后离心；

步骤c，取上清，加入预冷的异丙醇混匀，冷藏；冷藏后离心；弃上清，加入预冷乙醇，轻轻混匀洗净，离心；弃上清，晾干或吹干；

步骤d，加TE溶解DNA，室温放置；

步骤e，用TE将DNA稀释后作为PCR模板使用或冷藏保存备用。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定液为0.02% 冰醋酸和99% 酒精混合液。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述显影液为3% NaOH与0.5% 甲醛混合液。