[发明专利]一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法，其中，一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其包括引物、阻断剂和探针；所述引物包括针对Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。该试剂盒其敏感性和特异性达到筛查大肠肿瘤的要求，操作方便，结果稳定，具有重要的临床价值。

技术领域

本发明属于检测大肠癌技术领域，具体涉及一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法。

背景技术

大肠癌虽然是“可防可治”的肿瘤，但是我们并没有明显降低大肠癌的发病率和死亡率，肿瘤分期仍然是影响预后的唯一因素，探索适合大肠肿瘤的筛查方法是一个亟待解决问题。目前大肠癌筛查技术多使用粪便隐血检查结合乙状结肠镜或结肠镜检查，由于粪便隐血检查的敏感性和特异性较差，许多人不得不反复进行“阴性”肠镜检查，增加受检者的痛苦、增加了医疗费用，因此探索大肠肿瘤的非侵入性筛查方法是目前研究的最为热点的课题。从粪便脱落细胞的分子标记筛查大肠肿瘤和血液分子标记筛查大肠肿瘤是理想的方法，但是敏感性和特异性较低，在临床应用不十分广泛；同时如何增加人们对于大肠肿瘤筛查的意识，探索适合中国人群管理的大肠肿瘤筛查模式，是研究成果能否在临床广泛应用的关键。

Imperila等最近进行了一个9988人粪便甲基化检测筛查大肠癌的研究，对大肠癌敏感性达92％、对大肠息肉敏感性达42％，特异性达90％以上，说明通过粪便DNA甲基化可以作为筛查大肠癌和大肠腺瘤的工具。但是DNA甲基化与人种、饮食习惯、生活环境等有关，本组前期研究中，在分析国内现有单靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒的基础上，筛选了一系列的DNA甲基化标志，对其在大肠癌的筛查价值进行了研究，研究表明SNCA、SPG20、Septin9和FBN1 可以作为大肠肿瘤的筛查指标，本组设计了以SNCA等四个分子标记为靶点的筛查体系，并建立了阳性和阴性的内控体系，以进一步提高筛查大肠肿瘤的准确性。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。本品用于体外定性检测人粪便中Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因甲基化以筛查大肠癌及其癌前病变的方法。在大肠癌病人中，基因Septin9，SNCA，SPG20，FBN1的胞嘧啶会发生甲基化，而正常人中不发生甲基化。粪便中脱落细胞中的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1 基因发生的甲基化可以用过DNA的特异扩增而被检测到。在针对多个经肠镜确诊的大肠癌病例和阴性对照的研究报告中，都表明可以在大肠癌病人的粪便中通过检测Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因的甲基化而查到早期癌细胞的DNA。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种多靶点粪便DNA 甲基化检测大肠癌试剂盒，其包括引物、阻断剂和探针；所述引物包括针对 Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA， SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。

作为本发明所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒的优选方案，其中：所述引物、阻断剂、探针如序列SEQ ID NO.1～4、SEQ ID NO.6～19。