[发明专利]一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：包括引物、阻断剂和探针；

所述引物包括针对Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；

所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；

所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。

2.如权利要求1所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：所述引物、阻断剂、探针如序列SEQ ID NO.1～4、SEQ ID NO.6～19。

3.如权利要求1或2所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：还包括内参基因检测体系，所述内参基因的序列如SEQ ID NO.5。

4.一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：包括，

从粪便中收集肠粘膜细胞；

用粪便DNA提取试剂盒提取所述肠粘膜细胞DNA，再用亚硫酸盐进行转化，获得bisDNA；

将所述bisDNA进行多重PCR扩增获得模板基因用于检测。

5.如权利要求4所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增检测，其为反应体系为，

6.如权利要求4所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：所述检测，其为反应体系为，选择检测设备的FAM通道，同时选择HEX 或VIC通道。

7.如权利要求6所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：控制程序温度95℃，先运行1分钟，1次；再运行15s，共45次，结束后采集荧光；再控制程序温度60℃，运行60秒。

8.如权利要求7所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：若NC中FAM、HEX(或VIC)通道检测均无扩增或无Ct值，PC中FAM、HEX(或VIC)通道检测均有扩增且Ct值≤30，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验。

9.如权利要求7所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：若利用HEX/VIC通道进行内参基因检测，有扩增且Ct值≤25，则可继续分析；若利用HEX/VIC通道进行内参基因检测，Ct值较大或无扩增，但FAM通道的突变位点检测有扩增且Ct值≤38，则可继续分析。

10.如权利要求7所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：若样品中某突变位点检测的FAM通道有扩增且Ct值≤35，则判定该样本突变结果为阳性；若Ct值38或无扩增，则判定该样本突变结果为阴性；若35Ct值≤38，需重复实验，若Ct值仍在此范围内，则判定该样本突变结果为疑似阳性，所述疑似阳性的比例占总体占5％左右。