[发明专利]一种DNA接头及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种DNA接头，所述的DNA接头的非连接末端的5’和/或3’封闭。本发明的DNA接头可以避免非连接末端与DNA片段的非特异性连接，提升接头与DNA片段的连接效率，从而提升文库转化效率，本发明的DNA接头的制备方法简单，文库的构建方法简单、高效、成本低廉，可以避免高额的改造酶或商品试剂盒的花销。

技术领域

本发明具体涉及一种DNA接头及其制备方法和应用。

背景技术

二代测序实验中，基于DNA接头连接的DNA测序文库构建是一种重要且基础的实验技术。除单独应用于常规基因组测序文库构建外，该技术也是RNA-seq，ChIP-seq，RRBS等文库构建中的重要环节。DNA片段经a)末端补齐，b)加A，c)DNA接头连接及d)以与接头序列匹配的通用引物PCR富集后最终转化为DNA测序文库。显然，只有DNA片段的双端同时连接上DNA接头，该片段才可以在随后的PCR富集过程中被富集，进而被测序。双端连接上接头的DNA片段占所有DNA片段的比例也称作转化效率，是DNA文库构建质量的核心标准之一，不仅是常规DNA文库构建，更是一些高度关注原始有效分子的文库(如微量cfDNA文库、PCR-free文库)构建中必须考虑的问题。

为了提高连接效率，较常见的研究集中在对建库过程中各种功能酶与缓冲液的优化。比如，末端加A是DNA文库构建过程中的重要步骤，相较于平末端连接，末端3’端添加的A与DNA接头3’突出的T碱基可以介导连接效率更高的TA连接。因此有研究者开发或改进一些功能酶，以提高末端加A的效率。也有研究者通过连接优化缓冲液体系，通过添加高聚物聚乙二醇(PEG)，小分子丙二醇，甘油等试剂以实现高效率连接。这些研究虽也可有效提高连接效率，但或需复杂且高标准的设备生产改造酶，或因专利保护无法使用，或需花费较高的价格购买商品化试剂，因此，迫切需要开发一种简便的方法，用以提升文库转化效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高文库转化效率的DNA接头及其制备方法和应用。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

发明人在实验过程中发现，常规的Y型接头在连接时与DNA片段会发生非特异性连接，推测其可能与DNA接头本身非连接末端的3’羟基和/或5’磷酸有关。

为此，本发明一方面提供一种DNA接头，所述的DNA接头的非连接末端的5’和/或3’封闭，从而确保其不会干扰连接反应，从而提高DNA接头的连接效率。

本发明中所述的DNA接头的碱基组成可包含A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)、U(尿嘧啶)、5mC(5’甲基修饰的胞嘧啶)中的一种或多种。优选地，所述的DNA接头的非连接末端采用荧光基团封闭。

本发明中的荧光基团可以采用常用的荧光基团，但优选为FAM、HEX、ROX中的一种或多种。

本发明中用于对非连接末端5’、3’封闭的基团可以是相同的基团，也可以是不同的基团。

本发明的DNA接头可以是各种类型的接头，优选地，所述的DNA接头为Y型接头；其中，Y型接头包括但不限于常规Y型接头、含UMI Y型接头。

优选地，所述的非连接末端的5’磷酸和/或3’羟基封闭。

根据一种具体且优选实施方式，所述的DNA接头的非连接末端的5’和3’分别采用荧光基团封闭，从而可以在最常见的T4-DNA连接酶和缓冲液构成的连接体系中，使用该DNA接头进行连接，文库转化效率(双接头连接效率)从10％提升至60％甚至更高，本发明的接头可以简单、高效、成本低廉地提高文库转化率。

本发明的典型的非连接末端封闭的Y型DNA接头的结构图如图1所示。