[发明专利]一种利用组合生物合成技术制备地贝卡星的方法

说明书

本发明属于抗生素制药领域，涉及地贝卡星生物合成制备方法。具体地说，本发明利用庆大霉素生物合成中的双脱氧基因，通过组合生物学在产生卡那霉素B的菌种中进行内源性表达，获得地贝卡星生产菌株。本发明从棘孢小单孢链霉菌中克隆得到负责庆大霉素双脱氧过程的三个基因genP、genB3、genB4，其基因序列如SEQ ID NO.1‑3所示。通过组合生物学技术在产生卡那霉素B的链霉菌中表达双脱氧基因genP、genB3、genB4，双脱氧酶系在体内催化卡那霉素B的3’,4’羟基双脱氧生成地贝卡星。本发明利用双脱氧酶系通过组合生物学生物合成地贝卡星，极大降低化学合成的工业成本，环境友好，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及地贝卡星生物合成制备方法。具体地说，本发明利用庆大霉素生物合成中的双脱氧基因，通过组合生物学在产生卡那霉素B的菌种中进行内源性表达，获得地贝卡星生产菌株。

背景技术

地贝卡星(dibekacin，双脱氧卡那霉素B)属于半合成氨基糖苷类抗生素，它是一种新型的广谱抗生素，具有独特的化学结构与抗菌作用机制，与其他抗生素与抗菌药之间不但交叉耐药性小，而且多数呈协同作用。同时，地贝卡星也是重要的氨基糖苷类抗生素阿贝卡星的直接前体。

传统地贝卡星的制备，是以卡那霉素B为原料，通过一系列的化学反应脱去3’,4’位两个羟基。但传统化学合成的方法面临成本较高，工艺复杂，环境不友好等问题。

发明内容

庆大霉素的生物合成途径中有独特的3’,4’双脱氧过程。其中间体JI-20A、JI-20B和JI-20Ba经双脱氧酶系催化反应后，脱去3’,4’羟基对应生成庆大霉素C1a、C2和C2a。目前，本课题组已阐明genP、genB3、genB4负责催化庆大霉素的双脱氧过程。以JI-20A为例，GenP催化JI-20A磷酸化，GenB3催化磷酸化JI-20A生成西索米星，GenB4催化西索米星生成庆大霉素C1a。卡那霉素B与JI-20A结构相似(区别仅在于第三个糖环取代基不同)，在体外催化反应中以卡那霉素B为底物，经双脱氧酶系GenP-GenB3-GenB4催化成功可以得到地贝卡星。

卡那霉素B是许多微生物的次级代谢产物，或可通过基因技术手段提高卡那霉素B的产量或者使原本不产卡那霉素B的菌株产生该组分。如本课题组在卡那链霉菌中阻断kanJ，使卡那霉素B的产量提高了12倍；在黑暗链霉菌H6中阻断aprD3、aprQ、aprD4和tacA，获得卡那霉素B产生菌SPU314。

本发明的主要目的是提供一种地贝卡星生物合成的制备方法，即利用分子生物学技术构建地贝卡星生产菌株，通过生物合成直接发酵的方法制备地贝卡星。

本发明所述的制备方法包括以位点特异性整合、定点整合或游离质粒表达等形式将将负责3’,4’双脱氧的基因或酶系引入各种产生卡那霉素B菌种中生物合成地贝卡星的方法。

本发明通过如下技术方案实现：

本发明以卡那霉素B作为底物，通过将3’,4’羟基双脱氧基因在产生卡那霉素B的链霉菌中进行内源性表达或外源性加入3’,4’羟基双脱氧基因组成的双脱氧酶系，使卡那霉素B的3’,4’位脱羟基生成地贝卡星。

所述的3’,4’羟基双脱氧基因为genP、genB3、genB4的组合。

所述的genP、genB3、genB4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；

所述的genP、genB3、genB4的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。

所述的产生卡那霉素B的链霉菌为通过基因操作等生物技术手段得到的产生卡那霉素B的菌种。优选为黑暗链霉菌、卡那链霉菌。

进一步地，本发明包括如下步骤：

(1)双脱氧基因表达质粒的构建；