[发明专利]一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用

说明书

本发明涉及医学检测技术领域，为解决实时定量PCR法检测会导致大量“假阴性”病例出现的问题，以及流行病疫情爆发时对于大样本量检测的需求，本发明提出了一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法及其这种检测方法在呼吸道病毒感染上的应用，检测方法包括：获取样本并收集于含有RNA保护液的试管中；用RNA提取试剂盒提取RNA，利用一步法进行RNA逆转录及特定区域核酸的富集；一步法建立DNA文库并质检；进行二代测序；利用生物信息学技术对序列进行分析。检测方法具有高精度，高敏感性，高通量，快速检测的优势。

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法与应用。

背景技术

呼吸道病毒感染是引发流感的常见因素，某些病毒如SARS，MERS， 2019-nCoV等，由于其传播能力强，致病力强，甚至具有高死亡率的特点，对健康及社会公共危害性非常大。不同类型的流感病程发展不尽相同，对于不同类型的流感防治也截然不同，如何做到早发现，早诊断，早隔离，早治疗是防疫和治疫的重点。

不同流感的诊断标准是不同的，以2019-nCoV为例，目前的诊断标准是，有流行病学史，临床表现(呼吸道症状，影像学特征，白细胞数变化)，核酸检测阳性。常见的流感通过及时治愈一般不会发展为肺炎，而且传播能力相对较差，而上述恶性流感病毒的感染者往往具有很强的传播性，可以快速的发生严重的肺部病变，当CT检测已发现病灶时，患者病情往往已经比较严重，而且可能由于隔离及防护不及时，病原已大量传播。核酸检测，从原理上讲，是要比CT敏感和精确的，但是目前的实时定量PCR法由于本身的技术性限制以及其他多方面因素，会导致大量“假阴性”病例出现，其后果可导致确诊和治疗的延误，并且由于“核酸检测两次阴性”为治愈指标，很可能会导致非痊愈病人病情的反复以及更多的病原扩散。另一方面，随着疫情的发展，可疑病例也会不断增多，利用常规的RT-PCR方法可能无法满足大样本量快速检测的需求。因此，如何有效利用核酸检测的手段快速高效高通量且准确判断感染情况是迫切需要解决的问题。

二代高通量测序，近年来作为一种高通量高精度的核酸检测手段，逐渐成为临床诊断的重要手段，在孕产前中期，肿瘤早筛与治疗，遗传病检测与治疗，以及其他疾病的早筛领域发挥着巨大的作用。而对于呼吸道病毒感染的诊断，目前鲜有临床应用。一方面，普通流感致病性及死亡率低，且有较好的治疗方法，另一方面，传统的PCR或一代测序成本较低，因此对于二代测序进行流感诊断的研究并不多见，也未市场化。但是在没有有效疫苗及有效治疗方法的情况下，当重大疫情的发生时，大范围的筛查就显得至关重要了，二代测序技术便能够很好的应用于该领域。

发明内容

为解决实时定量PCR法检测会导致大量“假阴性”病例出现的问题，以及流行病疫情爆发时对于大样本量检测的需求，本发明提出了一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法及其这种检测方法在呼吸道病毒感染上的应用，检测方法具有高精度，高敏感性，高通量，快速检测的优势。

本发明通过以下技术方案实现：利用PCR与二代测序相结合的办法，通过对引物的创新性设计，先富集再测序，具有高精度(可以通过吻合序列提高特异性)，高敏感性(可检测到最低1000病毒拷贝/毫升，有利于早发现早诊断)，高通量(一次性可完成5000个病例的检测，可用于早期大量筛查以及流行病大样本研究)的优势。全部设计均用96孔板进行，因此可以通过全自动手段完成从核酸提取到建库的全部过程，从而避免对操作人员的污染和对环境污染的控制。

一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，如图1所示，包括以下步骤：

1、一种利用二代测序高通量检测呼吸道病毒的方法，所述的检测方法为以下步骤：

(1)取样、分组、进行孔板编码，

样本选自鼻咽或口咽吸痰或冲洗液、鼻咽或口咽拭子、气管吸痰和痰液、支气管肺泡灌洗液中的一种，然后收集含有RNA保护液的试管中。

具体步骤为：