[发明专利]一种组合标志物及其应用和检测试剂盒

权利要求书

1.一种组合标志物在制备用于糖尿病患者中视网膜病变诊断试剂或在糖尿病患者中视网膜病变诊断试剂盒中的应用；所述组合标志物包括乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇组成。

2.根据权利要求1所述的应用，所述的诊断试剂或试剂盒为包含采用气相色谱-质谱联用仪检测糖尿病患者血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的相对浓度的试剂的组合。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的采用气相色谱-质谱联用仪检测糖尿病患者血清中乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇相对浓度的试剂包括：

（1）标准化学品：乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇，所述标准品分别用于对应的血清中小分子代谢物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的定性；

（2）含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理糖尿病患者的血清样品，为包含内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的甲醇溶液，内标化合物的浓度分别为5~20 μg/mL；

（3）衍生化试剂：所述衍生化试剂用于预处理提取后的血清冻干样品溶解及衍生化反应；所述衍生化试剂包括浓度为15~20 mg/mL甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。

4.根据权利要求2所述的应用，其中检测步骤包括：

（1）首先用含内标化合物的提取液处理来自糖尿病患者的血清样本，沉淀血清蛋白并提取代谢物，离心取上清液真空冷冻干燥，冻干样品经甲氧胺溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺衍生化处理后采用气相色谱-质谱联用仪检测分析；

（2）在气相色谱-质谱联用仪检测获得的总离子流图上，提取经标准品定性后组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇各自的特征离子峰强度，以及内标化合物D5-苯丙氨酸、十三酸和D4-琥珀酸的特征离子峰强度；

（3）对每一个糖尿病患者血清样品中所述组合标志物的特征离子峰强度分别与内标化合物的特征离子峰强度相除进行校正，其中乙醇胺采用内标D5-苯丙氨酸校正，延胡索酸和亚牛磺酸采用十三酸校正，肌醇采用D4-琥珀酸校正，获得以上的四种代谢物各自的相对浓度值；

（4）基于以上所述组合标志物乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇的相对浓度值，通过二元逻辑回归方程计算组合型标志物变量Prob值，比较所得Prob值与最佳截点值的大小，从而判断糖尿病患者有无视网膜病变。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所建模型的二元逻辑回归方程为Prob =1/[1+e^{-（5.222*A+47.032*B+17.838*C+0.739*D-3.138）}]；其中Prob为糖尿病人群中患有视网膜病变的概率，A、B、C、D分别为乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇内标校正后的相对浓度；最佳截点值设为0.753，对于糖尿病人群，Prob值高于该截点值则为有视网膜病变，否则表明无视网膜病变。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：糖尿病患者包括有视网膜病变的糖尿病患者以及作为对照的无视网膜病变的糖尿病患者；所述有视网膜病变的糖尿病患者包括：1期轻度糖尿病性视网膜病变、2期中度糖尿病性视网膜病变、3期重度糖尿病性视网膜病变和4期增殖性视网膜病变中的一种或二种及以上。

7.一种用于糖尿病患者中视网膜病变的诊断试剂盒，所述试剂盒包含乙醇胺、延胡索酸、亚牛磺酸和肌醇标准品。

8.按照权利要求7所述的诊断试剂盒，还包含

（1）含内标化合物的提取液：所述提取液用于预处理来自糖尿病患者的血清样品，为包含内标化合物D4-琥珀酸、D5-苯丙氨酸和十三酸的甲醇溶液，内标化合物的浓度分别为5~20 μg/mL；

（2）衍生化试剂：所述衍生化试剂用于预处理提取后的血清冻干样品溶解及衍生化反应；所述衍生化试剂包括浓度为15~20 mg/mL甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。