[发明专利]一种微生物合成乙酰氨基酚的方法

说明书

本发明公开了一种在微生物合成乙酰氨基酚的方法，以单糖或甘油为原料产乙酰氨基酚，其包括如下步骤：将表达aroG^fbr pabA、pabB、pabC和Mnx1基因的微生物以单糖和/或甘油作为底物进行发酵得到含有对氨基苯酚的发酵产物；所述含有对氨基苯酚的发酵产物在表达NAT基因的微生物的作用下与乙酰辅酶A反应合成乙酰氨基酚。本发明可实现由单糖或甘油到乙酰氨基酚的微生物转化，为大规模的生物合成乙酰氨基酚提供了一个可行道路。

技术领域

本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及改造微生物代谢途径，从单糖或甘油发酵生物合成乙酰氨基酚的方法。

背景技术

乙酰氨基酚是使用最为广泛的镇痛和退热一线药物，又名扑热息痛(paracetamol)是非那西丁(phenacetin)的体内代谢产物，属于苯胺类。通过抑制下丘脑体温调节中枢前列腺素合成酶，减少前列腺素PGE1的合成和释放，导致外周血管扩张、出汗而达到解热的作用，其解热作用强度与阿司匹林相似，但无明显的抗炎作用；通过抑制前列腺素PGE1、缓激肽和组胺等的合成和释放，提高痛阈而起到镇痛作用，属于外周性镇痛药，作用较阿司匹林弱，仅对轻、中度疼痛有效。

目前已商品化的乙酰氨基酚均为通过化学法合成。化学法合成生长素需涉及到多个反应步骤导致合成成本较高。通过生物技术手段，实现微生物发酵单糖或甘油合成乙酰氨基酚，可有效的降低成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微生物体合成乙酰氨基酚的方法。

为实现上述目的，本发明提供了在大肠杆菌合成乙酰氨基酚的方法，生物合成路径图如图1所示，主要步骤为：

(1)构建产对氨基苯酚工程菌GDY1

将来自大肠杆菌的经人工合成解反馈抑制aroG^fbr(3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶,3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase)基因重组到载体pBBR1MCS1上，得到载体pDY001。将来自大肠杆菌的pabA(氨基脱氧分支酸合酶II,aminodeoxychorismate synthase,subunit II)、pabB(氨基脱氧分支酸合酶I,aminodeoxychorismate synthase,subunit I)、pabC(氨基脱氧分支酸裂解酶,4-amino-4-deoxychorismate lyase component of para-aminobenzoate synthase)及来自Candidaparapsilosis菌的经密码子人工合成Mnx1(黄素蛋白单加氧酶,flavoproteinmonooxygenase)基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY002。将载体pDY001和pDY002转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，实现上述基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株GDY1。表达解除反馈抑制的aroG^fbr基因用于加强大肠杆菌胞内分支酸的合成。表达pabA、pabB和pabC用于催化分支酸转化为对氨基苯甲酸，表达Mnx1用于催化对氨基苯甲酸转化为对氨基苯酚。上述构建的GDY1工程菌可有效的将单糖或甘油转化为对氨基苯酚。

(2)构建产对乙酰氨基苯甲酸工程菌GDY2

将来自大肠杆菌的pabA、pabB、pabC及来自Pseudomonas aeruginosa菌的经密码子人工合成NAT(芳胺乙酰转移酶,arylamine N-acetyltransferase)基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY003。将载体pDY001和pDY003转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，实现上述基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株GDY2。表达解除反馈抑制的aroG^fbr基因用于加强大肠杆菌胞内分支酸的合成。表达pabA、pabB和pabC用于催化分支酸转化为对氨基苯甲酸，表达NAT用于催化对氨基苯甲酸转化为对乙酰氨基苯甲酸。上述构建的GDY2工程菌可有效的将单糖或甘油转化为对乙酰氨基苯甲酸。