[发明专利]二硫键稳定的多肽组合物和使用方法

说明书

本文提供了包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的多肽，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。此类经修饰的人多肽可用于经由酶替代疗法和/或基因疗法治疗遗传疾病。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月10日提交的美国临时申请号62/744,069的权益，将所述申请通过引用以其整体特此并入本文。

背景技术

遗传疾病可以通过使用重组多肽的酶替代疗法或使用编码重组蛋白的核酸的基因疗法来治疗。例如，法布里病(Fabry disease)可以使用重组α-半乳糖苷酶A或小分子分子伴侣如1-脱氧半乳糖野尻霉素(米加司他(Migalastat))治疗。然而，重组野生型多肽通常在中性pH下稳定性较差，并且在血清中迅速降解。这大大限制了治疗性酶的半衰期，因为它是通过静脉内输注递送的。

发明内容

在某些方面，提供了包含核酸构建体的基因疗法载体，所述核酸构建体包含：编码用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式的核酸。在一些实施例中，所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α-半乳糖苷酶A、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、糖胺聚糖N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶、三肽基肽酶1(TPP1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白(ceroidlipofuscinoses neuronal)1、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白2、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白3、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白5、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白6、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白7、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白8、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白9、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白12、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白16以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α-半乳糖苷酶A、β-葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛酸酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶(NAGLU)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、糖胺聚糖N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、α-葡糖苷酶、三肽基肽酶1(TPP1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10(组织蛋白酶D)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11(颗粒蛋白前体)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13(组织蛋白酶F)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14(KCTD7)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15(TBCK)以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含溶酶体酶。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含稳定的α-半乳糖苷酶(α-GAL)蛋白。在一些实施例中，所述稳定的α-半乳糖苷酶A(α-GAL)蛋白包含选自下组的一个或多个非天然半胱氨酸残基，该组由以下各项组成：(i)D233C和I359C；以及(ii)M51C和G360C。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含稳定的棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)。在一些实施例中，所述稳定的PPT1蛋白包含非天然半胱氨酸残基A171C和A183C。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在pH 7.4下具有更长的半衰期。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质可以替代所述遗传障碍中有缺陷或不足的蛋白质。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质可以减轻或减缓与所述遗传障碍相关的一种或多种症状。在一些实施例中，与不稳定的蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在减轻或减缓所述遗传障碍的一种或多种症状方面更有效。在一些实施例中，所述遗传障碍是神经障碍。在一些实施例中，所述遗传障碍是溶酶体贮积症。在一些实施例中，所述遗传障碍选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、贝敦病(Batten disease)、胱氨酸病、法布里病、I型戈谢病(Gaucher disease)、II型戈谢病、III型戈谢病、庞贝病(Pompe disease)、泰-萨克斯病(Tay Sachs disease)、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、异染性脑白质营养不良、I型粘脂贮积病、II型粘脂贮积病、III型粘脂贮积病、IV型粘脂贮积病、贺勒病(Hurler disease)、亨特病(Hunter disease)、A型圣菲利波病(Sanfilippo disease)、B型圣菲利波病、C型圣菲利波病、D型圣菲利波病、A型莫奎欧病(Morquio disease)、B型莫奎欧病、马罗托-拉米病(Maroteau-Lamy disease)、斯莱病(Sly disease)、A型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、B型尼曼-皮克病、C1型尼曼-皮克病、C2型尼曼-皮克病、I型辛德勒病(Schindler disease)、II型辛德勒病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ADA-SCID)、慢性肉芽肿病(CGD)、婴儿期、幼年期和成年期形式的神经元蜡样质脂褐质沉积症以及CDKL5缺乏症。在一些实施例中，所述基因疗法载体是选自下组的病毒载体，该组由以下各项组成：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体。在一些实施例中，所述腺相关病毒是选自下组的血清型，该组由以下各项组成：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74、AAV-B1和AAV-hu68。在一些实施例中，所述核酸构建体包含在病毒载体基因组中。在一些实施例中，所述病毒载体基因组包含重组AAV(rAAV)基因组。在一些实施例中，所述rAAV基因组包含自互补基因组。在一些实施例中，所述rAAV基因组包含单链基因组。在一些实施例中，所述rAAV基因组包含第一反向末端重复序列和第二反向末端重复序列。在一些实施例中，所述AAV反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。在一些实施例中，所述rAAV基因组进一步包含SV40内含子。在一些实施例中，所述rAAV基因组进一步包含聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α-GAL蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:7-12之一至少85％相同。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α-GAL蛋白的核酸序列，其中所述α-GAL蛋白包含与SEQ ID NO:1-6之一至少85％相同的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α-GAL蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:8-12之一的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α-GAL蛋白的核酸序列，其中所述α-GAL蛋白包含SEQ ID NO:2-6之一的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码PPT1蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:15-16之一至少85％相同。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码PPT1蛋白的核酸序列，其中所述PPT1蛋白包含与SEQ ID NO:13-14之一至少85％相同的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码PPT1蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:16的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码PPT1蛋白的核酸序列，其中所述PPT1蛋白包含SEQID NO:14的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含启动子序列。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述构建体进一步包含选自下组的一个或多个核酸序列，该组由以下各项组成：Kozak序列、CrPV IRES、编码接头的核酸序列、编码信号序列的核酸序列和编码IGF2肽的核酸序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含免疫球蛋白结合蛋白(Bip)信号序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含所述Bip信号序列，其包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由SEQ ID NO:29-33组成。在一些实施例中，所述构建体进一步包含内部核糖体进入序列(IRES)。在一些实施例中，所述IRES包含蟋蟀麻痹病毒(CrPV)IRES。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码变体IGF2(vIGF2)肽的核酸序列。在一些实施例中，所述vIGF2肽包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由SEQ ID NO:17-27组成。在一些实施例中，编码所述vIGF2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的5'。在一些实施例中，编码所述vIGF2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的3'。在一些实施例中，所述构建体被包装在病毒衣壳内。