[发明专利]改进的多核苷酸序列检测方法

权利要求书

1.一种检测核酸分析物中的靶多核苷酸序列的方法，所述方法包括：

(a)将所述分析物退火至单链探针寡核苷酸A₀，以产生为至少部分双链并且其中A₀的3’末端与所述靶多核苷酸序列形成双链复合物的第一中间产物，其中所述单链探针寡核苷酸A₀包含引发区、在3’末端的与所述靶多核苷酸序列互补的区域和在与所述靶多核苷酸序列互补的区域的5’侧的寡核苷酸识别区，其中所述识别区包含条形码编码区，并且其中只有A₀的互补区能够退火至所述靶多核苷酸序列；

(b)在焦磷酸根离子源的存在下，使用焦磷酸解酶从A₀的3’末端在3’-5’方向上焦磷酸解所述第一中间产物，以产生部分消化的链A₁和所述分析物；

(c)(i)将A₁退火至单链触发寡核苷酸B，并在5’-3’方向上针对B延伸所述A₁链，其中B包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和在其5’末端的侧翼寡核苷酸区域，所述侧翼寡核苷酸区域与A₀或所述靶多核苷酸序列不互补；或者(ii)通过连接A₁的3’和5’末端使其环化；或者(iii)将A₁的3’末端连接到连接探针寡核苷酸C的5’末端；在每种情况下产生寡核苷酸A₂；

(d)用至少一种单链引物寡核苷酸引发A₂，并产生A₂的多于一个拷贝或A₂的区域的多于一个拷贝；和

(e)检测来源于所述多于一个拷贝的信号，并从其推断所述分析物中存在或不存在所述靶多核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中A₀的5’末端包含5’化学封闭基团、共同的引发序列和条形码区域。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用步骤(c)(ii)或步骤(c)(iii)，并且A₁在连接之前首先在5’-3’方向延伸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)(ii)和步骤(c)(iii)中的所述连接通过添加另外的夹板寡核苷酸D来进行，A₁在连接前退火至所述夹板寡核苷酸D，其中D包含与A₁的3’末端互补的寡核苷酸区域和与寡核苷酸C的5’末端或与A₁的5’末端互补的区域。

5.根据权利要求4所述的方法，其中由于3’修饰或通过D的3’末端和A₁的相应区域之间的错配，所述寡核苷酸D不能针对A₁延伸。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(c)之后，用核酸外切酶处理从步骤(c)产生的反应混合物以消化任何未连接的核酸材料，并且其中如果使用步骤(c)(iii)，所述寡核苷酸C还包含保护其免受3’-5’核酸外切酶消化的3’或内部修饰。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(d)之前，所述核酸外切酶被失活。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用步骤(c)(i)，并且其中步骤(d)中使用的引物寡核苷酸之一退火至A₂的延伸区域。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述探针寡核苷酸A₀具有耐核酸外切酶解的5’末端，并且其中在步骤(a)和(b)之后，用5’-3’核酸外切酶处理由此产生的反应介质，以除去任何不耐这种核酸外切酶解的核酸分子。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)在存在磷酸酶的条件下进行。