[发明专利]一种超微量RNA甲基化m6A检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种超微量RNA甲基化m6A检测文库的构建方法及其应用。相比于现有报道，本发明是专门针对较低起始量RNA检测m6A的方法；实验过程简捷，整个过程RNA完整，文库纯度高、质量好，特别适用于起始样本量少的情况，实现高效的连接，最终得到浓度足够高的文库，完成上机测序和后续的测序相关的应用，有效实现单细胞、外泌体或珍贵临床样本的MeRIP‑seq应用于诊断、治疗、研发等领域。

本申请要求了2018年12月28日提交中国专利局的，申请号为201811621335.X，发明名称为“一种超微量RNA甲基化m6A检测方法及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及高通量测序及文库构建领域，更具体地，涉及一种超微量RNA甲基化m6A检测方法及其应用。

背景技术

近年来的研究发现，RNA碱基第6个氮原子上的甲基化，也被称为m6A RNA修饰，具有高度保守性，广泛存在于大多数真核生物(如酵母、植物、果蝇、哺乳动物等)和病毒RNA中，在转录后RNA的处理和代谢中起着关键的调控作用[Methylation modifications ineukaryotic messenger RNA.J GenetGenomics.2014；41:21–3.]。

目前，检测RNA m6A修饰的技术主要是m6A RNA免疫沉淀结合高通量测序(MeRIP-seq)。该技术主要流程如下：

1)总RNA的分离和纯化：一般利用基于柱式法分离和纯化样本总RNA的试剂盒，常见的如QIAGEN公司、Takara公司的RNA提取和纯化试剂盒。该方法具有操作简捷，获取的RNA纯度较高、完整性较好、产量较高的优点；由于EDTA、盐类影响后续的打断，DNA影响m6A抗体对RNA的特异性识别，总RNA应避免EDTA、盐类和DNA的污染；

2)RNA的打断：利用化学方法(金属离子诱导)将总RNA打断为100nt的片段，简要来说，94℃孵育8-12min后立即加入EDTA转移到冰上。孵育时间和温度、残留EDTA和盐类、RNA浓度是RNA打断效率的关键影响因素；

3)免疫沉淀：利用m6A抗体与RNA m6A结合位点发生免疫沉淀反应；

4)洗脱RNA；

5)质量检测：qPCR检测免疫沉淀实验的可靠性；

6)文库制备；利用mRNA-seq或TruSeq制备文库；

7)测序；

8)生物信息学分析。

但目前MeRIP-seq技术仍需要300-500微克的总RNA。这在很大程度上限制了m6A修饰检测技术在临床和基础研究上的应用。因为在大多数情况下，从患者样本中获得数百微克的总RNA非常难，而且某些样本非常珍贵。尽管m6A是哺乳动物mRNA中最丰富的修饰方式，它在RNA的代谢中起着关键的调控作用，但m6A的作用由于缺乏有效的分析方法，阻碍了对人类疾病的深刻认识，特别是癌症的改变和动态仍然在很大程度上是未知的。因此，可应用于微量RNA样品的m6A分析方法将为理解人类疾病尤其是癌症中的m6A修饰机制提供坚实的基础。

因此，有必要提供一种适用于超低起始量即微量RNA样本的MeRIP-seq方法。

发明内容

本发明提供了一种超微量RNA甲基化m6A检测方法及其应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供了一种超微量RNA甲基化m6A检测文库的构建方法，包括如下步骤：

1)获取样品中的总RNA，打断并纯化，获得片段化处理后的产物；