[发明专利]一种超微量RNA甲基化m6A检测方法及其应用

权利要求书

1.一种超微量RNA甲基化m6A检测文库的构建方法，包括如下步骤：

1)获取样品中的总RNA，打断并纯化，获得片段化处理后的产物；

2)将1)所得产物加入含有抗m6A-抗体、蛋白A-磁珠、蛋白G-磁珠的沉淀缓冲液中，混匀孵化过夜；磁力分离，去上清，加入5×沉淀缓冲液和RNA酶抑制剂，反应1-3小时后，采用低盐沉淀缓冲液洗涤2-3次；再采用高盐缓冲液洗涤2-3次；采用酚氯仿裂解液提取RNA，获得纯化后的产物；

3)往cDNA第一链合成体系中加入步骤2)所得产物，合成第一链cDNA产物、PCR扩增，获得超微量RNA甲基化m6A检测文库。

2.如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述沉淀缓冲液的成分包括：

3.如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述低盐缓冲液的成分包括：

4.如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述高盐缓冲液的成分包括：

5.如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤3)中cDNA第一链合成体系包括逆转录引物、TSO引物；其中：

所述逆转录引物可形成茎环结构，所述逆转录引物的序列包括：

茎区-环区-茎区-poly(N)区，N选自ATCG中的任一种；

所述TSO引物的序列包括：

第一接头序列-第二接头序列-poly(G)区；

所得第一链cDNA的5'末端连接有所述TSO引物，3'末端连接有所述逆转录引物。

6.如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建方法，其特征在于，所述PCR扩增包括第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，其中，所述第一轮PCR体系中，采用的扩增引物包括如下引物组：

引物组一：FR引物、P7 RF引物，

其中，FR的序列包括：TSO引物的第一接头序列；P7 RF的序列包括：逆转录引物的环区-茎区序列；

所述第二轮PCR扩增中，采用的扩增引物包括如下引物组：

引物组二：P5 FR引物、P7 RF引物，

其中，P5 FR的序列包括：TSO引物的第一接头序列以及第二接头序列。

7.一种超微量RNA甲基化m6A检测方法，其特征在于，将如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库用于高通量测序，获得超微量RNA甲基化m6A检测结果。

8.一种超微量RNA甲基化m6A检测文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表1中的引物。

9.如权利要求8所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建试剂盒，其特征在于，所述超微量RNA甲基化m6A检测文库构建试剂盒还包括如权利要求2所述的沉淀缓冲液、如权利要求3所述的低盐缓冲液和如权利要求4所述的高盐缓冲液。

10.一种如权利要求1所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建方法或如权利要求7所述的超微量RNA甲基化m6A检测方法、或如权利要求7所述的超微量RNA甲基化m6A检测文库构建试剂盒在超微量RNA甲基化m6A检测中的应用。