[发明专利]一种鉴别中药材何首乌及其混伪品的环介导等温扩增引物组及方法、试剂盒与应用

说明书

本发明公开了一种鉴别中药材何首乌及其混伪品的环介导等温扩增引物组及方法、试剂盒与应用，本发明首次使用LAMP检测方法鉴别何首乌及其混伪品，克服了现有技术中因为何首乌与其他何首乌属的基因序列非常相似，如trnL‑trnF的变异区间较小，ITS2和matK序列重叠度高，较难找到LAMP技术鉴定的特异性基因序列和特异引物的技术难题。

技术领域

本发明属于中药分子检测技术领域，涉及一种中药材何首乌及其混伪品(翼蓼、毛脉蓼、齿叶蓼、耳叶牛皮消等)的环介导等温扩增检测方法，具体涉及一种鉴别中药材何首乌及其混伪品的环介导等温扩增引物组及方法、试剂盒与应用。

背景技术

何首乌，又名多花蓼、紫乌藤、夜交藤等，是蓼科蓼族何首乌属多年生缠绕藤本植物，何首乌是我国传统名贵中药，开发前景广阔。但混伪品翼蓼、毛脉蓼、齿叶蓼、耳叶牛皮消等严重影响何首乌饮片和制何首乌的安全和质量，急需建立灵敏、快速、简便的检测方法。

目前根据传统性状特征的方法鉴别，受发育阶段、外在环境及实验条件等诸多因素的影响，存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。根据理化特征、显微鉴别、薄层色谱、高效液相色谱、近红外光谱等方法鉴别，则样品前处理复杂、成本较高，同时对操作人员的技术要求较高。PCR法因高特异性、高灵敏度得到了广泛的应用。目前已有学者运用ITS、ITS2、trnL-trnF、matK等序列，利用PCR技术从基因的角度鉴别了何首乌及其多种混伪品，即DNA条形码鉴定法，PCR技术耗时长，模拟体内核酸扩增原理在体外须使用精密的控温设备，经过反复增降温而对核酸进行扩增的一种技术，存在扩增时间较长，且需要特殊的实验环境和昂贵的扩增仪等诸多不便。

环介导等温扩增技术(LAMP)是一门新兴的分子生物学检测技术，因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、操作简便和成本低等特点，越来越受到关注。该方法是对目的基因的6个区域设计4～6条特异性引物，利用链置换酶在60～65℃等温条件下30-60分钟内就可将目的基因扩增10⁹～10¹⁰倍，比PCR高出10倍的检测限；其扩增产物易检测，只需用肉眼观察有无白色浑浊或有无荧光，就可判断扩增是否发生。该技术特异性高，并且不需要热循环设备，省去了酶切、连接、预扩增等烦琐的步骤，节约了费用和时间，具有操作简单、方便快速的优点。

目前，LAMP技术在临床诊断、食品检疫及微生物检测等领域已经得到了广泛应用，但在中药材混伪品的检测报道很少，对何首乌的LAMP检测运用更是未见报道。可能是因为何首乌与其他何首乌属的基因序列非常相似，难以找到LAMP技术鉴定的特异性基因序列；以及现有技术中引物设计不合理，导致扩增的基因区分度低与模糊鉴定等问题，并且现有技术中还未见何首乌及其混伪品LAMP检测的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鉴别中药材何首乌及其混伪品的环介导等温扩增引物组及方法、试剂盒与应用，解决了现有技术中何首乌药材鉴定方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低、无法应用于基层检测等问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种鉴别中药材何首乌及其混伪品的环介导等温扩增引物组，所述引物组的序列如下：

正向内引物FIP：序列如SEQ ID NO：1所示；

反向内引物BIP：序列如SEQ ID NO：2所示；

正向外引物F3：序列如SEQ ID NO：3所示；

反向外引物B3：序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了上述环介导等温扩增引物组在制备鉴别何首乌及其混伪品试剂中的应用。

本发明还提供了一种鉴别何首乌及其混伪品的检测试剂，包括上述环介导等温扩增引物组。