[发明专利]一种检测GPVI基因启动子区甲基化水平的引物及其检测方法

说明书

本发明公开一种检测GPVI基因启动子区甲基化水平的引物及其检测方法，包括重亚硫酸盐转化后GPVI基因启动子区的扩增引物对和测序引物GPVI‑S；上游引物GPVI‑F的序列为5′‑ATTAGGGAGTTTATGGGAGTACGG‑3′，下游引物GPVI‑R的序列为：5′‑Biotin‑ATTCCTCAACCCTATCCTAAACTCTAT‑3′；测序引物GPVI‑S的序列为：5′‑AATATAGATTAGGTTTTAGTAGG‑3′。本申请采用焦磷酸测序法进行测序，高效检测目标区域CpG岛甲基化和非甲基化比例，评估GPVI启动子区甲基化水平，可作为发生心肌梗死的早期指标。

技术领域

本发明涉及生物基因检测技术领域。具体地说是一种检测GPVI基因启动子区甲基化水平的引物及其检测方法。

背景技术

血小板过度活化会引起不必要的血小板聚集，最终导致血栓形成，引发心血管疾病。近年来，很多研究显示冠心病发生发展过程中与基因表观遗传学DNA甲基化模式絮乱有密切关系。因此，研究DNA甲基化在冠心病发病过程中的作用机制，可为冠心病的诊断和治疗提供新思路。

在血小板参与冠心病发生发展过程中，血小板膜上的受体起着关键作用。糖蛋白VI(glycoprotein VI，GPVI)是血小板膜上众多受体之一，也是目前研发新型抗血栓药物的热门靶点。人GPVI基因定位于染色体19q13.4-42，DNA片段长度约为23000bp，基因组结构由8个外显子和7个内含子构成，为I型跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族的一员。GPVI只在血小板及血小板前体细胞--骨髓中的巨核细胞上表达，它是胶原的主要受体，介导血小板与胶原的黏附，并把这一黏附信号通过与其相连的FcRγ链“自外而内”传递到血小板内部，开始一系列介导血小板活化的活动，通过激活Syk激酶，发生信号级联放大反应，SLP76、PI3K、Btk、PLCγ2与PKC的逐步激活，胞质中Ca²⁺浓度升高引起细胞骨架的变化、血小板形状改变并分泌颗粒，这些血小板的反应通过血栓烷A2受体和腺苷二磷酸(adenosinediphosphate，ADP)受体P2Y1、P2Y12将信号进一步加强，最终使整合素αIIbβ3活化，血小板聚集，形成血栓。研究表明，缺乏GPVI可显著抑制胶原诱导的血小板黏附、聚集和血栓形成。在一例ITP患者血浆中检测到抗GPVI自身抗体，证实是其自身抗体特异性结合GPVI阳性血小板，清除血浆中可溶性GPVI，导致血小板不能结合胶原，也不能形成血栓。另外，敲除GPVI-Fc二聚体亦可有效阻止血小板聚集，但未延长出血时间，提示减少GPVI水平可阻止血栓形成，但又不引起病理性出血。另外，研究显示在心血管疾病患者中，GPVI在血小板膜上的表达量增加，且高水平GPVI与不良临床事件相关，是独立的心肌梗死的危险因素，提示GPVI异常增高可作为发生心肌梗死的早期指标。

表观遗传学是调控基因组功能的重要方式，DNA甲基化是表观遗传修饰中最重要的形式之一。大多数哺乳动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5′端的非编码区，并成簇存在。DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5′-CG-3′序列。一个CpG位点的DNA甲基化状态由DNA甲基转移酶和去甲基化酶共同调节，可通过细胞分裂遗传下去。当CpG位点处于甲基化状态时，会导致某些区域DNA构象变化，使其结构收缩，螺旋加深，从而影响转录因子或辅激活因子与DNA上相关调控区域的相互作用，而不利于转录的起始，导致靶基因表达降低，表现为沉默状态。相反地，当CpG位点处于去甲基化修饰状态时，染色体的紧缩结构将被打开，呈现出疏松的状态，有利于转录因子或辅激活因子接近于DNA序列，因此该修饰状态与基因的活化有关。通过基因序列分析发现在GPVI 5′调节区和启动子区-1576到+75间有多个CpG岛，我们前期研究发现，与健康组相比，冠心病组GPVI启动子区甲基化水平明显降低，而GPVI mRNA水平显著升高，提示GPVI通过启动子区甲基化调控自身基因表达。鉴于此，有必要建立了快速检测GPVI基因启动子区甲基化水平的方法。

发明内容