[发明专利]一种检测GPVI基因启动子区甲基化水平的引物及其检测方法

权利要求书

1.一种检测GPVI基因启动子区甲基化水平的引物，其特征在于，包括重亚硫酸盐转化后GPVI基因启动子区的扩增引物对和测序引物GPVI-S；

所述扩增引物对包括上游引物GPVI-F和下游引物GPVI-R，所述上游引物GPVI-F的序列为5′-ATTAGGGAGTTTATGGGAGTACGG-3′，所述下游引物GPVI-R的序列为：5′-Biotin-ATTCCTCAACCCTATCCTAAACTCTAT-3′；

所述测序引物GPVI-S的序列为：5′-AATATAGATTAGGTTTTAGTAGG-3′。

2.一种检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的扩增引物对，对重亚硫酸盐转化后人血液GPVI基因启动子区进行扩增，并使用所述测序引物GPVI-S对所检测的基因区域的5个CpG位点的甲基化比例进行检测，通过检测得到的甲基化率，测定GPVI基因在血液中的表达水平。

3.根据权利要求2所述的检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)血液样本采集；

(2)白细胞分离；

(3)基因组DNA提取；

(4)重亚硫酸盐转化；

(5)GPVI基因启动子区PCR扩增反应；

(6)琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物；

(7)焦磷酸测序反应和结果分析。

4.根据权利要求3所述的检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，使用EDTA抗凝管采集人静脉血2ml。

5.根据权利要求3所述的检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，使用Ficoll密度梯度法分离人静脉血中的白细胞。

6.根据权利要求3所述的检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用Biospin全血基因组DNA提取试剂盒提取白细胞基因组DNA。

7.根据权利要求3所述的检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，在步骤(4)中，使用EZ DNA甲基化全套试剂盒-gold中的重亚硫酸盐处理步骤(3)中基因组DNA样本。

8.根据权利要求3所述的检测GPVI基因启动子区甲基化水平的检测方法，其特征在于，在步骤(5)中，重亚硫酸盐转化后GPVI基因启动子区的扩增引物对，包括上游引物GPVI-F和下游引物GPVI-R，

上游引物GPVI-F的序列为5′-ATTAGGGAGTTTATGGGAGTACGG-3′，

下游引物GPVI-R的序列为5′-Biotin-ATTCCTCAACCCTATCCTAAACTCTAT-3′；所述扩增目标基因片段大小为166bp；

PCR扩增反应体系为：为30uL的混合体系，包括

0.3μL的TaKaRa Taq HS，TaKaRa Taq HS浓度为5U/μL；

3μL的10x PCR Buffer；

2.4μL的dNTP Mixture，浓度为2.5mM,

3μL的重亚硫酸盐处理后的基因组DNA，重亚硫酸盐处理后的基因组DNA的浓度为10～20ng·μL^-1；

1.0μL的上游引物GPVI-F，上游引物GPVI-F的浓度为10μM；

1.0μL的下游引物GPVI-R，下游引物GPVI-R的浓度为10μM；

19.3μL的无菌去离子水；

PCR反应程序为：

(P-1)95℃预变性2min，

(P-2)95℃变性10s，

(P-3)55℃的退火30s，

(P-4)72℃延伸30s，

(P-5)步骤(P-1)到步骤(P-4)循环30次，

(P-6)72℃终延伸5min。