[发明专利]香蕉细菌性枯萎病菌环介导等温扩增检测方法

说明书

本发明涉及一种香蕉细菌性枯萎病菌检测方法，更具体涉及一种对香蕉细菌性枯萎病菌进行环介导等温扩增的检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。本发明利用模板DNA互补结合的特点，在香蕉细菌性枯萎病菌特异性基因片段序列上设计，通过引物进行环介导等温扩增，建立香蕉细菌性枯萎病菌环介导等温扩增检测方法，可以缩短传统香蕉细菌性枯萎病菌检测时间，确保检测的特异性和灵敏度。而且这种方法可以缩短传统病原菌检测的周期、提高通关速度。这对于提高进境大宗农产品疫情截获检出率，提高防范外来有害生物入侵能力，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本都具有重大的意义。

技术领域

本发明涉及一种香蕉细菌性枯萎病菌检测方法，更具体涉及一种运用对香蕉细菌性枯萎病菌进行环介导等温扩增的检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。

背景技术

香蕉细菌性枯萎病(mokodisease)是香蕉生产上最具毁灭性的病害之一。香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2)是危害香蕉最严重的病原细菌。19世纪90 年代, 南美特立尼达岛暴发了造成香蕉品种“Moko”毁灭性损失的病害,香蕉细菌性枯萎病由此得名为“Moko disease”。20世纪60年代,Budenhagen等确定香蕉细菌性萎蔫病菌的分类归属为茄科假单胞菌Pseudomonassolanacearum的2号生理小种, 1994年更名为茄科雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum (Smith)Yabuuchietal.(Buddenhagen, I,Sequeira, L and Kelman, A,1962; Buddenhagen, I W,1960)。自然条件下,香蕉细菌性枯萎病菌的寄主范围仅局限于芭蕉科芭蕉属的香蕉、大蕉及海里康属的海里康。该病为典型的维管束病害,在寄主植物的各生育期均可发生危害,且难以在不杀死寄主的情况下加以控制。在中、南美地区, 由香蕉细菌性枯萎病造成的香蕉产量损失问题迄今未得到有效解决,成为该地区香蕉产业发展的重要限制因子。

茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum种以下有不同的生理小种，根据寄主的不同而分为5个生理小种，香蕉细菌性枯萎病菌则属于其中的2号生理小种。香蕉细菌性枯萎病菌主要侵害三倍体香蕉及赫蕉，可致使植株发生严重的枯萎，最终导致整株死亡。香蕉细菌性枯萎病菌是我国禁止进境的检疫性有害生物，在我国未见分布。我国虽然对进境香蕉和香蕉种苗进行检疫，但对进境芭蕉属(Musa)和蝎尾蕉属(Heliconia)的景观类植物未进行该细菌的检测，而这些植物也可作为香蕉细菌性枯萎病菌寄主，对携带并传入该病菌存在一定的风险。

由于目前我国尚无正式存在的报道，所以被我国列为入境检疫性有害生物，在我国口岸检疫中，一直沿用传统的分离培养、鉴别寄主反应、生理生化鉴定和血清学检测等方法 (国外也应用现代分子生物学方法检测香蕉细菌性枯萎病菌)但是这些方法耗时长、效率和灵敏度均较低，经验性很强，而且普通PCR需后处理，如琼脂糖凝胶电泳，致癌物染色等，这样不但容易产生污染，增加假阳性出现的风险，而且对实验室工作人员身体有害，我们建立的实时荧光检测方法有效地解决了上述问题。漆艳香等(漆艳香，谢艺贤，张辉强，等,2005)根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异,设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外,还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。王念武等(王念武，陈劲松，沈建国，等,2015)根据香蕉细菌性枯萎病菌的特异插入序列ISRso19设计滚环扩增的锁式探针,并对超分支滚环扩增的反应条件进行优化,建立了香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增技术。结果表明,该检测技术能够从供试的9种病原菌中特异性地检测出香蕉细菌性枯萎病菌,检测的DNA最低浓度为500 fg•μL-1,高于常规PCR的灵敏度。