[发明专利]一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌。本发明所述工程菌在通过二氢青蒿酸酿酒酵母异源合成途径改造的酿酒酵母基础上，使其原有表达ALDH1的序列为表达突变的ALDH1^H194R或ALDH1^V247F的序列。本发明对路径的关键基因ALDH1进行定点突变以获得选择性更好的基因，使代谢路径更偏好二氢青蒿酸的合成，降低青蒿酸所占比例。两个突变体ALDH1^H194R和ALDH1^V247F在本发明中证明可提高二氢青蒿酸/青蒿酸的比例。在此基础上，将DBR2和ADH1融合表达，同时将突变ALDH1与DBR2融合表达可进一步提高二氢青蒿酸/青蒿酸比例且不牺牲二氢青蒿酸的产量。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

青蒿素是一种有效抗疟疾药物，其众多的衍生物都被世界卫生组织于2002年认定为一线抗疟疾药物。目前，青蒿素的获得方式主要是从植物青蒿中直接提取。青蒿在世界各地均有分布，但绝大数青蒿中青蒿素含量都很低(≤1‰)，且提取成本较高。而化学合成法从头合成青蒿素，因青蒿素分子本身结构复杂，导致合成难度高，成本高，在经济上不可行。而生物半合成方法获得青蒿素成为最佳的选择，即通过基因工程改造微生物使其生产青蒿素前体青蒿二烯、青蒿酸或二氢青蒿酸等，再通过几步简单的化学合成方法合成青蒿素。

其中，二氢青蒿酸是合成青蒿素的最直接的前体物质，所有其他的前体物质(如青蒿酸等)都需要用化学方法先合成到二氢青蒿酸，才能进一步合成青蒿素。

如Paddon CJ等人在2013年利用酿酒酵母先异源合成大量青蒿酸，再通过化学法合成二氢青蒿酸，进而合成青蒿素。但是，这种先用生物法合成青蒿酸再用化学法转化生成二氢青蒿酸的过程中会产生11-S型的手性二氢青蒿酸作为副产物，这个副产物不能作为后续合成青蒿素的原料的。

而在利用微生物异源直接合成二氢青蒿酸的技术中则可避免这种情形，例如二氢青蒿酸可以用酿酒酵母直接异源合成，2008年，Zhang Y等人通过表达DBR2等关键基因，首次在酿酒酵母内合成二氢青蒿酸；

二氢青蒿酸是一种倍半萜的衍生物，其已构建出来的酿酒酵母异源生物合成途径如下：酵母利用乙醇为碳源，先将其转化为乙酰-CoA，然后进入甲羟戊酸(MVA)途径，合成15个碳的法尼基焦磷酸(FPP)，再以FPP为底物，通过青蒿二烯合成酶(ADS)的催化合成青蒿二烯，随后被P450单氧化酶CYP71AV1氧化为青蒿醇，CPR1和CYB5可辅助这一步骤的进行，之后青蒿醇在ADH1催化下合成青蒿醛，青蒿醛在DBR2催化下合成二氢青蒿醛，最后经过ALDH1催化生成二氢青蒿酸，同时青蒿醛又可以直接被ALDH1催化生成副产物青蒿酸，具体合成途径见图1。在该途径中，酿酒酵母所缺少的关键酶为ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1，在不考虑产量的前提下，将表达这些酶的序列通过基因整合方式或重组质粒方式，导入到酿酒酵母中，即可生产处二氢青蒿酸。

专利CN201610876830.X以上述代谢途径为基础，将代谢通路所需要的几个关键酶ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1通过基因整合以及质粒导入的方式完成了重组菌株的构建，同时还过表达一些酿酒酵母内源基因，使酿酒酵母合成二氢青蒿酸的产量可提高到1.17g/L。

虽然利用微生物异源直接合成二氢青蒿酸的技术中，不会出现合成手性二氢青蒿酸副产物的情况，但是会同时生成青蒿酸作为副产物，现有专利CN201610876830.X所构建的重组菌株，其二氢青蒿酸/青蒿酸的比例仅为2.53，这表明青蒿酸在其中所占比例过高，影响目标物质的生成。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产二氢青蒿酸的酿酒酵母工程菌及其构建方法，使所述工程菌能够显著提高二氢青蒿酸/青蒿酸的比例，降低青蒿酸的产出；