[发明专利]应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法

说明书

本发明公开了一种应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，该方法将待测对象的尿液作为检测样本，采用数字PCR法对尿液中的前列腺癌特异的lncRNA进行检测。本发明利用数字PCR检测尿液样本中lncRNA，尿液样本中lncRNA含量较低，因此与传统的荧光定量PCR相比，本发明的方法具有检测更灵敏、检测限更低且能进行绝对定量的优势。本发明使用病人的尿样进行检测，与传统的血液样本或肿瘤组织样本相比，检测样本更易获得且对病人的伤害更小。本发明操作简单，简化了程序，易于重复，易于自动化检测，且检测灵敏、检测限低。

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，特别涉及一种应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法。

背景技术

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。前列腺癌早期常无症状，难以进行诊断，易造成治疗时机的延误，严重危害我国男性健康。目前临床诊断前列腺癌主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查，上述方法均难以检出早期前列腺癌的病变，且直肠指诊、经直肠前列腺超声给患者带来的痛苦较大，血清PSA检查需要进行取血，盆腔MRI检查具有操作繁琐成本较高的缺点，因此目前迫切需要一种操作简便，取样简单并且对患者没有伤害的前列腺癌早期筛查方法。

专利：CN201810150462.X，公开了一种用于早期诊断人前列腺癌的长链非编码RNA及制备、用途，其公开了lncRNA MYU能作为前列腺癌诊断和治疗靶标的基因。

专利：CN201710992491.6，公开了一种人前列腺癌早期诊断用长链非编码RNA序列及其应用，其公开了长链非编码RNA PRCAT38(即本申请中所述的lncRNA PCSEAT)能够作为前列腺癌检测的新标志物。

数字PCR(dPCR)是一种新的绝对定量PCR，主要是对PCR反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。

dPCR是一种核酸分子绝对定量技术。dPCR一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光定量分析。在PCR扩增阶段，与传统技术不同，dPCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几万个反应腔室里反应。这样子相当于变相的对靶基因进行富集。与此同时，由于对原样品的大幅度的稀释，使得PCR抑制剂浓度显著降低，这样dPCR对初始PCR反应物里抑制剂的要求显著低于荧光定量PCR(qPCR)。

不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，dPCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

相对于荧光定量PCR(qPCR)而言，dPCR具备以下优势：

1、灵敏度可达单个核酸分子：检测限低至0.001％，原因在于dPCR可以实现靶标DNA/RNA的富集；

2、无需标准品(标准曲线)，即可对靶分子起始量进行绝对定量；

3、特别适合基质复杂样品的检测：终点PCR检测，不依赖Ct值，不依赖扩增效率，能克服PCR抑制剂的影响，适合动血样、FFPE组织、粪便、尿液、痰液、水样、土壤、植物等复杂样品中DNA的绝对定量；

4、能够有效区分浓度差异(变化)微小的样品：更好的准确度、精密度和重复性，可以用于精确测定靶基因的相对表达，基因拷贝数变异分析等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法。