[发明专利]应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法

权利要求书

1.一种应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，该方法将待测对象的尿液作为检测样本，采用数字PCR法对尿液中的前列腺癌特异的lncRNA进行检测。

2.根据权利要求1所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

1)采集待测对象的尿液并进行预处理，得到处理后的检测样本；

2)对处理后的检测样本进行RNA提取，获得总RNA；

3)进行逆转录，得到模板；

4)以得到的模板为原料之一配制数字PCR检测体系，并进行数字PCR检测。

3.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，所述数字PCR检测体系包括自制预混液、正向引物、反向引物、HotstartHiTaq、双蒸水以及所述步骤4制得的模板。

4.根据权利要求3所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，所述自制预混液包括以下原料：MgCl₂、NH₄Cl、Tris-HCl、BSA、dNTP、甘油、海藻糖、Poloxamer 188、EvaGreen、鱼精DNA、Tween-20和NaN₃。

5.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：

1-1)将待测对象的尿液收集至无菌离心管中；

1-2)4℃、3000r/min离心5分钟，弃上清，收集尿沉渣；

1-3)将尿沉渣使用PBS溶液重悬，于4℃、3000r/min离心5分钟，弃上清，收集尿沉渣；

1-4)将尿沉渣收集于离心管中，加入Trizol试剂反复吹打均匀，得到处理后的检测样本，放入-80℃冰箱备用或直接进行RNA提取。

6.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：

2-1)向所述步骤1)制得的处理后的检测样本中加入Trizol溶液，涡旋混匀，静置五分钟；

2-2)向每1mlTrizol溶液中加入0.2ml氯仿，涡旋混匀静置2-3分钟；

2-3)4℃、12000g离心15分钟，吸取上清水相至新的1.5ml离心管中；

2-4)向每1ml Trizol溶液得到的上清中加入10μg无RNA酶的糖原和0.5ml异丙醇，涡旋混匀后静置10分钟；

2-5)4℃、12000g离心10分钟，弃去上清；

2-6)向每1ml Trizol溶液得到的沉淀中加入1ml体积分数为75％的乙醇，颠倒混匀；

2-7)4℃、7500g离心5分钟，弃去上清；

2-8)将得到的RNA沉淀静置干燥5-10分钟；

2-9)将RNA沉淀使用20-50μl无RNA酶水重悬，得到提取的总RNA，保存于-80℃冰箱备用或直接进行逆转录。

7.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：

3-1)去除基因组DNA反应：将步骤2)得到的总RNA为原料之一配制反应混合液，进行反应，去除总RNA中的基因组DNA；

3-2)逆转录反应：以步骤3-1)得到的反应产物为原料之一配制反应混合液，进行逆转录反应，得到模板。

8.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测前列腺癌患者尿液中长非编码RNA的方法，其特征在于，所述扩增反应程序为：98℃保持30s；95℃保持15s、68℃保持1min并重复40个热循环；68℃保持10min；12℃保温，程序结束。