[发明专利]一种双染法检测细菌活菌的方法

说明书

本发明公开了一种双染法检测细菌活菌的方法，包括如下步骤：细菌培养、细菌稀释、洗涤重悬、加入反应试剂避光孵育、使用流式细胞仪分析。本发明取得的有益效果为：检测快速、准确，克服了传统qPCR假阳性较高、平板培养检测周期长等缺点，使结果更加有效、可靠。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种双染法检测细菌活菌的方法。

背景技术

细菌性青枯病是由青枯菌引起的一种广泛分布于世界热带、亚热带和一些温暖地区的毁灭性病害。青枯菌的寄主范围非常广泛，目前已发现44个科的几百种植物可能被其侵染，并且不断有新的寄主被发现，给作物生产带来了很大的经济损失。

大肠杆菌是许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。大肠杆菌在肠道中大量繁殖，大约占粪便干重的1/3，其可随粪便散布在周围环境中，影响周边环境的卫生；若在水中和食品中检出此菌，可认为水质或食品已被粪便污染，从而推测其可能有肠道病原菌的存在，因此，大肠杆菌常作为饮水和食物的卫生学指标。

目前，用于青枯菌和大肠杆菌检测的常用方法为PCR检测和平板培养方法。但是PCR检测技术不仅能扩增活菌的DNA，自由状态的DNA或死菌DNA也能被扩增，导致假阳性的出现；而平板培养方法则有培养周期长等缺点。

因此，提供一种快速、准确的检测细菌活菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速、准确的检测细菌活菌数的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双染法检测细菌活菌的方法，包括如下步骤：

(1)细菌培养：将细菌接种于液体培养基中，摇床震荡培养至对数生长期，得到菌种液；

(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的菌种液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至 5×10⁵～1×10⁶cfu/ml，得细菌稀释液；

细菌直径为0.5～5μl，在得到单细胞菌种稀释液前增加了1000目不锈钢筛网过滤，以除去聚集成团的细菌。

(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的细菌稀释液100μl于无菌流式管中，先用去离子水洗涤，再向洗涤后的细菌稀释液中加入200～400μl Annexin VFITC结合液重悬细菌，得细菌重悬液；

(4)向步骤(3)的细菌重悬液中加入5μl浓度为0.5～10μg/ml的AnnexinV FITC溶液和10μl浓度为10～50μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育 10～20min；

(5)分析：孵育完成后，立即用流式细胞仪分析。

Annexin V FITC与PI(碘化丙锭)双染法的原理是处于死亡早期的细菌因细胞膜的磷脂对称性改变而使PS(磷脂酰丝氨酸)暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的连接素V(Annexin V)，但细菌仍维持其细胞膜的完整性，使变性染色质着色的荧光染料PI不能进入细菌；然而，死亡晚期的细菌可同时受Annexin V FITC与PI标记，用FCM(流式细胞仪)可定量分析受标记的死亡的细菌数。

优选的，步骤(1)的培养条件为：培养温度25～30℃，培养时间8～12h，转速为200～300r/min。

优选的，步骤(3)中去离子水洗涤的过程具体包括：将细菌稀释液在4℃条件下3000r/min离心5min，收集沉淀，之后使用1ml去离子水重悬，4℃条件下3000r/min离心5min，收集沉淀，如此重复2次。