[发明专利]一种双染法检测细菌活菌的方法在审
| 申请号： | 201910823802.5 | 申请日： | 2019-09-02 |
| 公开（公告）号： | CN110607343A | 公开（公告）日： | 2019-12-24 |
| 发明（设计）人： | 周大祥;李婧怡 | 申请（专利权）人： | 重庆三峡学院 |
| 主分类号： | C12Q1/10 | 分类号： | C12Q1/10;C12Q1/04;C12R1/01;C12R1/19 |
| 代理公司： | 11465 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 404120 重*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 细菌 流式细胞仪 避光孵育 反应试剂 平板培养 细菌培养 假阳性 活菌 稀释 重悬 洗涤 分析 | ||
1.一种双染法检测细菌活菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)细菌培养：将细菌接种于液体培养基中，摇床震荡培养至对数生长期，得到菌种液；
(2)细菌稀释：将步骤(1)得到的菌种液用无菌蒸馏水重悬，1000目无菌不锈钢筛网过滤，细胞计数板计数后，无菌蒸馏水稀释菌液浓度至5×105～1×106cfu/ml，得细菌稀释液；
(3)洗涤重悬：取步骤(2)得到的细菌稀释液100μl于无菌流式管中，先用去离子水洗涤，再向洗涤后的细菌稀释液中加入200～400μlAnnexinVFITC结合液重悬细菌，得细菌重悬液；
(4)向步骤(3)的细菌重悬液中依次加入5μl浓度为0.5～10μg/ml的Annexin V FITC溶液和10μl浓度为10～50μg/ml的PI溶液，混匀后于室温避光孵育10～20min；
(5)分析：孵育完成后，立即用流式细胞仪分析。
2.如权利要求1所述的一种双染法检测细菌活菌的方法，其特征在于，步骤(1)的培养条件为：培养温度25～30℃，培养时间8～12h，转速为200～300r/min。
3.如权利要求2所述的一种双染法检测细菌活菌的方法，其特征在于，步骤(3)中去离子水洗涤的过程具体包括：将细菌稀释液在4℃条件下3000r/min离心5min，收集沉淀，之后使用1ml去离子水重悬，4℃条件下3000r/min离心5min，收集沉淀，如此重复2次。
4.如权利要求3所述的一种双染法检测细菌活菌的方法，其特征在于，步骤(5)中用流式细胞仪分析的激发波长为490nm，发射波长为533nm。
5.如权利要求1～4所述的一种双染法检测细菌活菌的方法，其特征在于，所述细菌为青枯菌或大肠杆菌。
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