[发明专利]一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法，属于医学基因检测技术领域。本发明基于实时荧光PCR技术，在FAM19A4、has‑miR‑124‑2、ZNF671基因的启动子区设计特异性的甲基化检测的引物和探针，并配制成PCR反应液去扩增硫化后的样本DNA，通过与内参基因β‑actin对样本的质量进行控制，判断样本是否甲基化。与常规的方法相比，本方法具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，对宫颈癌的早期诊断及预后判断起重要作用。

技术领域

本发明涉及医学基因检测技术领域，尤其涉及一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法。

背景技术

宫颈癌一直是困扰女性的重要恶性肿瘤。正常的宫颈细胞经过癌前病变发展成为宫颈癌，可能长达几十年。在这整个过程中部分HPV病毒的感染可被自身免疫系统修复而自动转归为正常，而另外一部分与宫颈癌联系更紧密的癌前病变则需及时进行干预来阻止癌前病变发展成为宫颈癌。

目前我国临床上应用的主要筛查手段为细胞学检测方法，包括巴氏涂片法和液基细胞学(TCT)。但细胞学检测方法的检测流程包括取样-抹片制备-观察-结果判读等多个环节，易受到人为影响的可能性较大，造成漏检的几率较高。并且，自从宫颈癌归因于HPV病毒持续感染后发展起来的HPV-DNA检测。因为其检测的仅仅是HPV病毒的存在与否，而HPV病毒的存在，大部分是一过性的，也就是意味着这些被自体免疫清除掉的HPV感染也会被判定为阳性，导致过度治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法，所述试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合，包括以下甲基化基因：FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671。

本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，所述引物和探针用于检测上述方案所述FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671；所述引物和探针组合包括FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P；

所述FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：9所示。

优选的，所述FAM19A4探针P和has-miR-124-2探针P、ZNF671探针P的5’端采用FAM标记；所述FAM19A4探针P、ZNF671探针P和has-miR-124-2探针P的3’端采用MGB标记。

本发明还提供了一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述的引物和探针组合、β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P；所述β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～SEQID NO：12所示。

优选的，所述β-actin探针P的5’端采用VIC标记；所述β-actin探针P的3’端采用MGB标记。

优选的，所述试剂盒还包括10×PCR Buffer，Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。