[发明专利]一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合、引物和探针组合、试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于宫颈癌甲基化检测的甲基化基因组合，包括以下甲基化基因：FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671。

2.一种用于宫颈癌甲基化检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针用于检测权利要求1所述FAM19A4、has-miR-124-2和ZNF671；所述引物和探针组合包括FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P；

所述FAM19A4正向引物F、FAM19A4反向引物R、FAM19A4探针P、has-miR-124-2正向引物F、has-miR-124-2反向引物R、has-miR-124-2探针P、ZNF671正向引物F、ZNF671反向引物R和ZNF671探针P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：9所示。

3.根据权利要求2所述的引物和探针组合，其特征在于，所述FAM19A4探针P、ZNF671探针P和has-miR-124-2探针P的5’端采用FAM标记；所述FAM19A4探针P、ZNF671探针P和has-miR-124-2探针P的3’端采用MGB标记。

4.一种用于宫颈癌甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的引物和探针组合、β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P；所述β-actin正向引物F、β-actin反向引物R和β-actin探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～SEQID NO：12所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述β-actin探针P的5’端采用VIC标记；所述β-actin探针P的3’端采用MGB标记。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×PCRBuffer，Taq酶、dNTPs、无核酸酶水、阳性对照和阴性对照。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括宫颈癌细胞株CaSki；所述阴性对照包括宫颈癌细胞株C33A。

8.权利要求4～7任意一项试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)提取待检样本DNA；

2)将所述待检样本DNA经亚硫酸盐转化处理，得到转化后的DNA；

3)以所述转化后的DNA为模板，利用权利要求2或3所述的引物和探针组合进行PCR扩增反应，得到荧光检测结果；

4)根据所述荧光检测结果，对待检样本进行判定，当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4或miR-124-2任一基因ΔCt≦9，则判定待检样本为宫颈癌甲基化阳性；当β-actin≤35，且检测结果为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671基因ΔCt＞9，则判定待检样本为FAM19A4、has-miR-124-2、ZNF671甲基化阴性；当β-actin＞35，则判定样本不足或有抑制物存在，PCR反应无效，需重复实验或采样；

所述ΔCt＝FAM Ct-VIC Ct。