[发明专利]基于石榴全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用

说明书

本发明公开了基于石榴全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用，该引物组包括11对引物：PG080、PG130、PG139、PG152、PG153、PG140、PG098、PG070、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1‑22所示。本发明的SSR核心引物组具有多态性高，重复性好、标记稳定、带型清晰易判读等优点，可用于石榴品种鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等领域，为石榴分子标记辅助选择提供了新的工具，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用石榴全基因组序列开发SSR核心引物组及在石榴品种鉴定、指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究中的应用。

背景技术

微卫星(Simple Sequence Repeats，SSR)标记，是指以1～6个核苷酸为单位，广泛存在于基因组中的简单重复序列。SSR具有分布广、共显性遗传、多态性高、检测方便且稳定的特点，被广泛应用于品种鉴定、遗传多样性评价以及系统发育关系研究、遗传图谱构建及QTLs定位等诸多研究领域。前期，SSR标记的开发主要基于基因组DNA文库或者富含特异微卫星的文库，该方法工作量大且得到的标记数量比较有限；近年来，随着全基因组测序工作的完成，基于全基因组序列开发SSR标记，可获得的标记数量丰富，覆盖整个基因组，且在基因组上分布均匀，被广泛应用于多种已测序植物中。

石榴是最早被人类认识可以食用的果树，原产于波斯地区(今伊朗)一带，公元前5世纪开始被人类驯化。据记载，石榴在张骞出使西域时传入我国，在我国已有2000多年的栽培的历史。石榴遗传资源丰富，据《中国果树志(石榴卷)》记载，我国现有石榴资源300多份，根据风味可分为甜石榴和酸石榴，根据籽粒硬度可分为硬籽石榴和软籽石榴，根据其利用部位可分为观赏石榴和食用石榴，根据颜色分可为红皮、白皮、黄皮以及粉皮石榴等。由于石榴独特的营养、保健、观赏以及显著的经济和生态效益，石榴的栽培范围逐渐扩大，地方间引种频繁；但由此也带来了石榴品种间混杂严重，给石榴生产者和育种者带来了新的挑战。

基于石榴栽培历史悠久、资源丰富、品种交流频繁的现状，开展石榴品种鉴定、指纹图谱构建、遗传多样性评价及系统发育关系研究均有重要的现实意义，然而该工作的有效开展有赖于多态性高、重复性好、标记稳定的分子标记开发。基于此，根据已有的石榴基因组序列，在全基因组上开发SSR标记核心引物具有重要的价值。

发明内容

本发明的目的是在于提供利用全基因组数据快速开发SSR标记，挑选引物组，这些引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于石榴品种鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等领域。

本发明第一方面提供了一种基于石榴全基因组序列开发的SSR核心引物组，该引物组包括11对引物：PG080、PG130、PG139、PG152、PG153、PG140、PG098、PG070、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-22所示。

本发明第二方面提供了上述基于石榴全基因组序列开发的SSR核心引物组的开发方法，包括如下步骤：

(1)石榴基因组DNA提取：采用CTAB法提取DNA，加入50μL0.1M的TE缓冲液，溶解过夜，-20℃保存备用；

(2)石榴全基因组数据从DDBJ/ENA/GenBank数据库下载，序列号MTKT00000000；利用MISA软件在全基因组范围内挖掘不同重复单元SSR位点，SSR查找的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重复次数分别为11、8、6、5、4；

(3)SSR引物设计