[发明专利]一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高密度细胞发酵方法，尤其涉及一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法。所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述工程菌可分泌高活性重组精氨酸脱羧酶，并且该工程菌可应用于中试高密度发酵培养，使重组精氨酸脱羧酶工业化生产成为可能。本发明发酵培养方法通过对发酵培养基的筛选及发酵诱导培养条件的优化，通过控制甘油、氨水的补加时间、补加速率及用量控制碳源与氮源的供应，通过调整搅拌转速，通气量控制氧的供应，从而实现菌体高密度生长和目标蛋白酶大量表达。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种高密度细胞发酵方法，尤其涉及一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法。

背景技术

精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)，是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖型脱羧酶，以L-精氨酸为底物，脱去羧基后生成胍基丁胺(见图1)。胍基丁胺作为一种重要的生物胺，具有很大的生理功能和医药价值，而目前企业主要采用化学法生产胍丁胺，生产过程复杂，对环境污染严重。生物酶法具有环保、高效等特点，如何采用精氨酸脱羧酶大规模生产胍基丁胺，是人们研究的热点。

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)体内存在两种精氨酸脱羧酶基因，一种编码基因为adiA；另一种编码基因为speA。中国专利申请(CN105062943A)公开了一种利用高产精氨酸脱羧酶的重组菌生产胍基丁胺的方法，所述重组菌以E.coli BL21(DE3)为宿主、pET20b(+)为表达载体，表达来源于E.coli BL21的精氨酸脱羧酶基因speA。利用所述重组菌生产精氨酸脱羧酶的方法，是将重组菌种子液接种至发酵培养基(SOC培养基)，培养至OD₆₀₀为0.7，然后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG诱导，所得精氨酸脱羧酶的比酶活可达0.53U/mg。王鹏根据NCBI发表的E.coli MG1655中精氨酸脱羧酶基因adiA序列和pET-28a载体多克隆位点构建得到精氨酸脱羧酶基因工程菌(王鹏.氨基酸脱羧酶重组表达及应用研究[D].南京大学,2015.)。中国专利申请(CN105861529A)将来源于腐败西瓦氏菌的精氨酸脱羧酶在大肠杆菌内表达，产生的精氨酸脱羧酶用于转化L-精氨酸生产胍基丁胺，产量为61～71g/L，转化率为68～82％。

综合现有技术报道并结合实际生产经验，发明人发现以不同来源的编码精氨酸脱羧酶的基因构建基因工程菌，所得重组精氨酸脱羧酶的酶活及转化能力存在明显不同，且现有技术中的培养方法所得到的发酵液中菌体浓度不高，进而导致精氨酸脱羧酶表达量不高。目前几乎未见将所得重组菌用于高密度发酵生产精氨酸脱羧酶的报道。此外，不同发酵培养基，不同诱导培养方式以及不同的发酵调控方式也会影响基因工程菌的发酵生产能力。因此开发一种高效的精氨酸脱羧酶的生产方法对精氨酸脱羧酶的产业化应用有重要的实践意义。

发明内容

本发明的主要目的是实现高活性重组精氨酸脱羧酶的高密度发酵培养。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种精氨酸脱羧酶基因工程菌，所述基因工程菌以E.coliK12为宿主，以pET28A为载体，重组表达adiA基因；所述adiA基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明目的之二，提供以上所述精氨酸脱羧酶基因工程菌的高密度发酵培养方法，所述方法包括：种子液培养；将种子液接种到发酵培养基中，发酵诱导培养；补加碳源、氮源；控制溶氧量等。

碳源为甘油或葡萄糖，氮源为氨水、蛋白胨或酵母粉；优选的，碳源为甘油；氮源为氨水。

本发明目的之三，提供利用以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶。

本发明目的之四，提供以上所述方法得到的重组精氨酸脱羧酶在制备胍基丁胺中的应用。