[发明专利]基于固体纳米孔道的单酶检测分析方法

说明书

本发明公开了一种基于固体纳米孔道的单酶检测分析方法，包括：在芯片上形成纳米孔道，所述芯片包括基底及设于基底上的金属层；在纳米孔道内固定单个酶分子，所述酶分子处于金属层靠近基底的一端；使芯片处于含酶底物的溶液中，芯片将所述溶液分隔为两部分，两部分的溶液通过纳米孔道连通，两部分溶液中分别放置电极，施加极化电压，监测周期性电流信号，进行信号分析，获得酶的催化信息。本发明利用固体纳米孔技术固定单个生物酶分子在纳米孔限域空间内，在外加电场条件下，检测纳米孔道内部离子流变化，对单酶催化动态进行研究，对周期性电流信号进行分析，可以获得酶的催化信息包括酶的构象信息、酶的催化活性、酶的构效关系等。

技术领域

本发明涉及酶的检测分析，尤其涉及一种基于固体纳米孔道的单酶检测分析方法。

背景技术

生物酶分子具有催化活性的蛋白质、DNA、RNA等生物分子，具有降低反应活化能，提高反映速率的功能，研究酶催化过程中酶分子功能与结构间的关系可以进一步指导催化反应研究，进一步提高催化效率。目前研究生物分子空间结构的主要技术是X射线晶体衍射法，但是这种方法要求待测样品纯度高、浓度大，且晶体状态结构固定，无法反映分子行使功能过程中分子结构变化的动态信息。于是有发展了在溶液状态下研究蛋白质结构等方法，如紫外吸收法、荧光光谱、圆二色谱等，但是这些研究方法都是在大体积溶液条件下进行，测得的是无数多个酶分子同时发生催化反应的平均结果，某些酶分子特异性的结构转变都会因平均效应而被掩盖，因此无法获取单个酶分子催化反应过程中结构与功能关系的信息。

为了准确获取生物分子结构与功能的关系，而不是无数分子的统计平均结果，单分子研究显得格外重要。由于单分子静态异致性，不同环境下的分子可能具有不同的生物活性或者构型状态，并且各状态下的转换又具有动态异致性。例如酶分子发生催化反应时，哪种构型构像状态下的酶分子最容易与底物分子发生结合，哪种构型构象状态下的酶分子最容易释放产物，哪种构型构像状态下的酶分子催化速率更快，这些都需要从单酶动态研究中寻找结果。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于固体纳米孔道的单酶检测分析新方法。

技术方案：本发明所述的基于固体纳米孔道的单酶检测分析方法，包括：

(1)在芯片上形成纳米孔道，所述芯片包括基底及设于基底上的金属层；

(2)在纳米孔道内固定单个酶分子，所述酶分子处于金属层靠近基底的一端；

(3)使芯片处于含酶底物的溶液中，芯片将所述溶液分隔为两部分，两部分的溶液通过纳米孔道连通，两部分溶液中分别放置电极，施加极化电压，监测周期性电流信号，进行信号分析，获得酶的催化信息；其中所述酶的催化信息包括酶的构象信息、酶的催化活性、酶的构效关系中的一种或几种。

本发明将单个酶分子固定在固体纳米孔道限域空间内，酶分子的结构变化会改变孔内电荷分布，发明人研究发现，添加酶底物后，会产生周期性电流信号，对周期性电流信号进行分析，获得基线电流值和信号频率，发现两者明显相关，当酶分子结构松散或以横向方式位于纳米孔中时，酶分子在纳米孔内的占位效应大，基线电流绝对值小，同时酶分子与金层距离远，电子传递速度慢，周期性信号频率低；而当酶分子结构紧密或以纵向方式位于孔中时，酶分子在纳米孔内的占位效应小，基线电流绝对值大，同时酶分子与金层距离近，电子传递速度快，周期性信号频率高。将反应酶电子传递速度的电流信号频率与反应酶结构变化的电流基线联系起来，则可以分析得出酶分子功能与结构间的关系(即构效关系)。对于酶来讲，电子传递速度的快慢反应了酶活性的高低，因此通过基线电流值或/和信号频率的大小，可以对酶的活性高低进行比较判断，进一步对酶随时间的活性动态进行分析。其中，对周期性信号进行分析时，通过对获得的周期性离子电流信号进行全点统计分析，获取到基线电流值或/和信号电流，用快速傅立叶变换对周期性离子电流信号进行分析，获取到信号频率。