[发明专利]利用双重数字PCR定量检测莲蓉中芸豆成分的方法

说明书

本发明提供了一种利用双重数字PCR定量检测莲蓉中芸豆成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将芸豆物种特异性基因序列和莲子物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述芸豆物种特异性基因序列和所述莲子物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到芸豆占莲子和芸豆的DNA拷贝数百分比，换算得到芸豆成分占莲子和芸豆成分的质量百分比。本方法可准确、快速地为检测出莲蓉中芸豆成分的质量百分比含量，为莲蓉馅料真实性鉴别提供准确可靠的技术数据。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用双重数字PCR定量检测莲蓉中芸豆成分的方法。

背景技术

莲蓉是一种以莲子为主要原料，辅以植物油、糖，经过粉碎、搅拌、高温、高压等多种加工工艺制成的蓉沙馅料。《SB/T 10563-2010 莲蓉馅料》明确规定莲蓉馅料中除植物油、糖外，莲子含量应不低于60%（w/w），纯莲蓉馅料中除植物油、糖外，莲子含量为100%（w/w）。芸豆是莲蓉馅料中最为常见的配料组成，不法商家往往通过增加配料中价格低廉的芸豆比例来降低成本，不当获利。2012年，《羊城晚报》报道部分莲蓉月饼生产商以掺入芸豆的掺假莲蓉馅料生产月饼，谋取高额利润。

现有的检测技术手段很难从莲蓉成品辨别原材料的真伪和比例，为掺假提供了极大的便利和可操作空间。《GB/T 23814-2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法》采用PCR-琼脂糖凝胶电泳技术对莲子和芸豆成分进行定性检测，对莲蓉生产加工过程中由于共用容器、设备和生产线等造成的“无意污染”和以掺假为目的的“有意添加”不能进行有效区分，存在明显的技术局限性，不能满足莲蓉馅料打假的需求。

为保障饮食安全，维护公平合法贸易，建立莲蓉中芸豆成分双重数字PCR定量检测方法，可对莲蓉中掺入的芸豆成分进行精准定量，对莲蓉的真伪鉴别提供准确可靠的技术依据。

发明内容

本发明的目的在于针对以上要解决的缺点与不足，提供一种利用双重数字PCR准确、有效地定量检测莲蓉中芸豆成分的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用双重数字PCR定量检测莲蓉中芸豆成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将芸豆物种特异性基因序列和莲子物种特异性基因序列检测的探针分别标记为VIC和FAM，通过在同一PCR反应体系中测得的所述芸豆物种特异性基因序列和所述莲子物种特异性基因序列的拷贝数浓度，计算得到芸豆占莲子和芸豆总成分的DNA拷贝数百分比，换算得到芸豆成分占莲子和芸豆总成分的质量百分比。

优选地，本发明的方法包括以下步骤：

步骤1.提取莲蓉样品DNA；

步骤2.设计并合成所述莲子物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述芸豆物种特异性基因序列的引物和探针序列；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4.采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

步骤5.根据荧光信号检测结果计算所述芸豆占莲子和芸豆的DNA拷贝数百分比，换算得到芸豆成分占莲子和芸豆成分的质量百分比；

其中，所述芸豆占莲子和芸豆的DNA拷贝数百分比，其中a为芸豆特异性基因拷贝数浓度，b为莲子特异性基因拷贝数浓度。

其中，所述芸豆成分占莲子和芸豆成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得。

优选地，所述步骤1包括将所述莲蓉样品采用试剂盒法提取样品DNA。

优选地，所述步骤2中，所述莲子特异性物种基因序列的引物和探针序列如下：