[发明专利]一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：表达载体pET‑22b‑m的构建，表达载体pET‑22b‑m中M蛋白的表达，口服微球疫苗的制备。本发明的有益效果在于：本发明所用的海藻酸钠及壳聚糖皆为天然多糖，安全无毒、无污染，能够稳定增加目的蛋白的稳定性和均一性，壳聚糖本身能够抑制细菌活性，为微球疫苗的长久稳定保存提供了保障；本发明提供的制备方法，过程简单，耗费时间少，制备成功率高；本发明提供的一种IHNV基因工程口服微球疫苗，释放性、耐酸性良好，通过免疫实验发现该疫苗对虹鳟鱼有一定的免疫保护作用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及对动物病毒性传染病基因疫苗的研究，具体涉及一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)是鱼类病毒性病原体的一种，能引起鳟鱼(Oncorhunchus mykiss)、鲑鱼(Salmo salar)等冷水鱼的造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis，IHN)。IHNV是20世纪50年代在华盛顿及俄勒冈州红大马哈鱼(Oncorhynchus nerka)孵卵期的鱼苗身上首次被发现的，它随着带病毒鱼的粪便、尿、性腺产物等的排泄排入水中，再通过鱼鳃和消化道侵入健康鱼体，进而实现病毒的传染。IHNV的传播方式一般是水平传播，但是也存在垂直传播或鱼卵传播的方式。

IHNV呈典型弹状，弧形的一端直径约20nm，平坦的一端直径约80nm，长度约170nm，为反义单链RNA病毒，有囊膜；脂蛋白包膜表面有纤细的刺突，厚约15nm。IHNV基因组大小约为11100bp，从3’端依次编码核衣壳蛋白(NucLeocapsid protein,N)、聚合酶相关磷酸蛋白(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、糖蛋白、非结构蛋白及RNA聚合酶蛋白。目前，根据IHNV的G基因的变异系数分为五个基因型：U(upper)、M(middle)、L(lower)、E(Europe)和JRt(Japanese rainbow trout)，基因分型与地理的相关性高于宿主因素和时间因素。

IHNV不耐酸、不耐热，对游离碘、乙醚、甘油、氯仿等较为敏感，于50％甘油中保存1～2周可失去活性。IHNV能在虹鳟性腺细胞系(Rainbow trout gonad,RTG-2)、鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulossum of crap,EPC)、大鳞大麻哈鱼胚细胞系(Chinooksalmon embryo,CHSE-214)、肥头鲦鱼细胞(Fathead minnow,FHM)等细胞系上生长，其中FHM和EPC对其最为敏感。IHNV在细胞中培养的最佳温度为15℃左右，高于23℃时IHNV会停止复制。

研究表明，虹鳟鱼对于IHNV的抵抗，主要包括3种方式，一是非特异性免疫，当虹鳟鱼被IHNV感染或者G蛋白的刺激，会诱导IFN(包括I型干扰素和II型干扰素)产生，IFN中的I型干扰素会进一步诱导具有GTP酶活性的Mx蛋白产生，Mx蛋白具有广谱的抗病毒活性，对多种DNA病毒和RNA病毒有抑制作用；同时当虹鳟鱼被被IHNV感染后，促炎症反应、替代补体途径、凋亡、吞噬作用、自然杀伤细胞活力、分泌及内吞作用中的免疫相关基因的表达均有上调，这些基因的表达的上调能够提高对IHNV的抵抗力；二是先天性免疫屏障，在鱼类的表皮组织先天存在病毒防御系统，可抵抗病毒入侵，限制病毒在鱼体内扩散，并可以启动鱼体警报系统；三是特异性的细胞免疫，当虹鳟鱼被IHNV感染或者疫苗诱导，可以产生中和抗体和特异性细胞免疫反应，产生一定的抵抗作用。但是这3中抵抗方式都不是非常有效的，尤其是在IHNV暴发的急性阶段。原因主要包括以下几个方面：IHNV的复制速度比先天性免疫反应的速度快；抗体产生的速度较慢，在感染几周后才能检测到，且病毒滴度达到一定阈值才能激发虹鳟鱼产生保护抗体。