[发明专利]一种IHNV基因工程口服微球疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1.1 表达载体pET-22b-m的构建

1.1.1 PCR扩增获得目的片段：取IHN患病虹鳟组织，分离IHNV，之后采用所述IHNV感染EPC细胞，之后提取EPC细胞的RNA，并以所述RNA作为模板，上游引物M-F和下游引物M-R为引物进行RT-PCR扩增反应，获得cDNA；再以所述cDNA为模板，以所述上游引物M-F和下游引物M-R为引物，使用TransTaq-T DNA聚合酶进行PCR扩增反应，获得目的片段；

1.1.2 目的片段和表达载体pET-22b的双酶切：将所述目的片段和表达载体pET-22b分别使用限制性内切酶Nde Ⅰ和HindⅢ进行双酶切获得两段双酶切产物，之后将所述两段双酶切产物分别进行回收，获得载体双酶切产物和目的片段双酶切产物；

1.1.3 双酶切产物连接：将所述载体双酶切产物和目的片段双酶切产物通过T4 DNA连接酶进行连接反应，获得表达载体pET-22b-m；

1.2 重组菌中M蛋白的表达及纯化

1.2.1 重组菌BL21(pET-22b-m)的制备：将所述表达载体pET-22b-m转化到E.coliBL21感受态细胞中，并将所述感受态细胞涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，获得重组菌BL21(pET-22b-m)；

1.2.2 M蛋白的诱导表达：将所述重组菌BL21(pET-22b-m)接种于含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养液中，37℃过夜活化；次日将所述过夜活化的菌液按体积比1％接种于含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养液中，37℃培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.8mM，之后在26℃、180rpm条件下诱导表达6h；

1.2.3 重组菌株的超声破碎：用离心管收集诱导表达后的菌液，之后8000rpm，离心10min，弃上清，用滤纸将上清吸干，加生理盐水重悬沉淀获得重悬液；之后在冰浴中对所述重悬液进行超声破碎，所述超声破碎条件为功率400W，破5s，歇10s，至所述重悬液呈蛋清状，结束超声破碎过程；之后在4℃、14000rpm条件下离心10min，收集上清，即为待纯化菌液。

1.2.4 M蛋白的纯化：将所述待纯化菌液用Ni-NTA层析柱进行纯化，获得纯化后的M蛋白；

1.3 口服微球疫苗的制备：取10mL所述纯化后的M蛋白作为抗原，加入10mL2％的海藻酸钠搅拌混匀，再加入100mL大豆油，冰浴中8×10³r/min搅拌10min充分乳化；再加10mL3％CaCl₂溶液，冰浴中500r/min搅拌15～30min充分复乳化，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，用75％酒精洗涤三次后收集沉淀，称为沉淀1；加30mL PBS重悬所述沉淀1，加30mL 1％壳聚糖，冰浴中500r/min搅拌2h，之后4℃、4000g离心15min，弃上清，用75％酒精洗涤三次后收集沉淀，称为沉淀2，并将所述沉淀2放到-80℃冰箱中预冷30min；将预冷后的所述沉淀2放入已预热30min的冷冻干燥机中，4℃真空冻干24h，即获得IHNV基因工程口服微球疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.1中所述目的片段的大小为509bp。

3.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.1中所述PCR扩增反应的条件为94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的一种IHNV基因工程口服微球疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1.1中所述上游引物M-F的序列为5′-ACAGTTCTGATCCCTCCTCC-3′；所述下游引物M-R的序列为5′-GTCTCCTGGGCATAGTAGTC-3′。