[发明专利]一种双sgRNA位点敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法，具体涉及一种双sgRNA位点敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统与应用，本发明首次双位点敲除法，采用在同一外显子上设计两个sgRNA序列，针对该外显子上两个位点进行切割，可高效敲除RSPH6A基因，且只需PCR、电泳即可确定是否敲除成功，大大降低了敲除后鉴定成本，且敲除后只有一种突变型，大大增加了敲除结果的稳定性；将含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9系统转染细胞，可获得敲除RSPH6A基因的细胞株。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及肿瘤发生、发展相关基因敲除方法，具体涉及一种双sgRNA位点敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统与应用。

背景技术

RSPH6A(radial spoke head 6 homolog A)基因编码的蛋白质类似于海胆径向辐条头蛋白。径向辐射蛋白复合物形成真核鞭毛轴丝的一部分，位于双管微管的外环和中心的微管对之间。径向辐射蛋白能够调节动力蛋白的活性和鞭毛弯曲模式的对称性，在肿瘤转移过程中起重要左右，深入研究RSPH6A有助于发现肿瘤转移的重要机制，为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路，同时也是肿瘤新标记物的重要寻找方向。

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来消除入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链RNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA的进行定点切割，CRISPR/Cas系统具有操作简单，剪切效率高等特点。

目前，CRISPR/Cas基因敲除技术已广泛应用于果蝇、大鼠、小鼠、斑马鱼等实验模型。传统的敲除方法使用一个sgRNA，针对一个位点进行敲除，虽然效率高，但DNA自主修复不确定性高，且缺失1个碱基不宜于鉴定，往往需要大量测序，花费大量资金进行鉴定。

发明内容

本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种双sgRNA位点敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统与应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种敲除RSPH6A基因的sgRNA，包括RSPH6A sgRNA-1和RSPH6A sgRNA-2；

所述RSPH6A sgRNA-1的序列如下：

RSPH6A sgRNA-1：TCTTTCGGGCGTTCACGATC；(SEQ ID No.1)

RSPH6A sgRNA-1 oligo1：5’-caccgTCTTTCGGGCGTTCACGATC-3’；(SEQ ID No.2)

RSPH6A sgRNA-1 oligo2：5’-aaacGATCGTGAACGCCCGAAAGAc-3’；(SEQ ID No.3)

所述RSPH6A sgRNA-2的序列如下：

RSPH6A sgRNA-2：GGCCCAGATAGCCCGCATCT；(SEQ ID No.4)

RSPH6A sgRNA-2 oligo1：5’-caccgGGCCCAGATAGCCCGCATCT-3’；(SEQ ID No.5)