[发明专利]一种双sgRNA位点敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统与应用

权利要求书

1.一种敲除RSPH6A基因的sgRNA，其特征在于，包括RSPH6A sgRNA-1和RSPH6A sgRNA-2；

所述RSPH6A sgRNA-1的序列如下：

RSPH6A sgRNA-1：TCTTTCGGGCGTTCACGATC；

RSPH6A sgRNA-1 oligo1：5’-caccgTCTTTCGGGCGTTCACGATC-3’；

RSPH6A sgRNA-1 oligo2：5’-aaacGATCGTGAACGCCCGAAAGAc-3’；

所述RSPH6A sgRNA-2的序列如下：

RSPH6A sgRNA-2：GGCCCAGATAGCCCGCATCT；

RSPH6A sgRNA-2 oligo1：5’-caccgGGCCCAGATAGCCCGCATCT-3’；

RSPH6A sgRNA-2 oligo2：5’-aaacAGATGCGGGCTATCTGGGCCc-3’。

2.一种双sgRNA位点靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括权利要求1所述RSPH6A sgRNA-1和RSPH6A sgRNA-2的DNA序列。

3.如权利要求2所述的双sgRNA位点靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9载体LentiCRISPR V2，得到酶切后的载体；

步骤2，将所述靶向敲除RSPH6A基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后与酶切后的LentiCRISPR-V2载体连接，得到得到靶向敲除RSPH6A基因的LentiCRISPR V2-RSPH6AsgRNA-1&LentiCRISPR V2-RSPH6A sgRNA-2，构建靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统。

4.如权利要求2或3所述靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统在制备敲除RSPH6A基因的细胞株中的应用。

5.一种敲除RSPH6A基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株是运用权利要求2所述双sgRNA位点靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除得到的细胞中的RSPH6A基因缺失的细胞株。

6.如权利要求5所述敲除RSPH6A基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株为A549细胞株。

7.如权利要求5所述敲除RSPH6A基因的细胞株，其特征在于，所述RSPH6A基因的具体靶向敲除位点为：

AGGATGTGCTGTGTGTGATGCACCCAGTTGGCCATGGAGTCGACCAGCTCCAGCACGGGGATGCCCTCGAAGTCCGGGTTCTCCTCGTAGGAGTCGCGCCCAGCACCACCTTCCTCCTCCTCGTCGCCCTCCTCCTCACTAAACTGGTAGAAGCCCAGCGGGCTGACCTGCGTGGCGGCCAGAT-------------------------------------------------------TCTCGGGCTGGAGTGACGTGGGGCAGCCGCGTCCATGGCAGGCCCGGCTCGTTGCACACAAAGTACAGGTACTTGTTGGCGCCTGAGCGGCTCTCCTCCTTGGGGATCACGGGCGGCGGCTTCCATACGGACTTAGGGACGATGTCCACGGCCTTCTCCTCGTCCTCCTCGCCCTCCTCCTCGCCGTGCGCCTCCATGACCTCGCCACCTTCCGTCATCTCCTCCACCTCCTCCTCCTCTGCCTCCTCCTCGCCCTCCCGGAATTCCACCTCGGCCACCAGGTAGCTGCGTTTGATTCCCAGGAT。