[发明专利]一种检测双链断裂产生试剂活性的方法

说明书

本发明涉及一种检测双链断裂产生试剂活性的方法，其中通过延伸引物和随机序列的分子信标的设计，从而实现对所述试剂编辑效率和特异性的双重检测。

技术领域

本发明提供了一种同时检测双链断裂产生试剂，特别是工程核酸酶(engineerednuclease)的编辑效率和特异性的方法。

背景技术

在基因工程中，常常需要合适的基因组编辑工具以实现对目标基因或者基因组片段的操作，而能够在目标基因组序列中造成双链断裂是各类基因组编辑工具工程的基本功能。其中一类应用广泛的双链断裂试剂就是工程核酸酶(engineered nuclease)，其包括meganucelases、锌指核酸酶(zinc finger nucleases)、类转录活化因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)以及CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedproteins)等，能够精确的在几乎任何基因组位置实现靶向编辑，从而实现了对基因组的精确修饰。在其中，源于细菌以及古细菌的免疫系统的CRISPR/Cas，能够利用靶位点特异性的RNA指引Cas蛋白对靶位点序列进行修饰，由于其高效率和简便性，近年来引起了广泛的关注，已成为一种新型高效的基因组编辑工具。

然而，包括CRISPR/Cas在内的工程核酸酶均存在着脱靶活性，即在与靶位点有一定序列差异的其它基因组位置上造成切割，有时甚至会导致染色质重排，这大大增加了基因编辑带来的风险，从而极大限制了基因编辑手段在临床治疗上的应用。现有技术中已经开发得到了一些检测核酸酶的编辑效率和特异性的方法，例如靶向高通量测序被广泛用于评估通过PCR扩增的基因组片段内的插入缺失(Mali等人，2013)，这些数据可用于粗略估计核酸酶的切割效率，但是这些方法并不能估计核酸酶的特异性；而LAM-HTGTS则通过将靶基因位点的全基因组易位作为诱饵来鉴定脱靶位点(Frock等，2015)具有了检测其编辑特异性的能力。但是，该方法首先进行了80个循环的线性扩增以产生原始DNA片段的多个拷贝，这将导致难以将PCR扩增产物与原始模板进行区分。此外，文库制备期间的限制酶阻断导致低估未切割或完全修复的靶片段和小插入片段，因而无法量化靶位点周围的DSB修复产物(Hu等人，2016)，因此该方法不能有效的定量分析切割效率。本领域迫切需要一种方法能够更加精确的对工程核酸酶的切割能力以及切割特异性或脱靶活性进行评价的方法。

发明内容

发明人经过长期的研究，本发明提供了一种能够同时定量分析基因组编辑工具(例如工程核酸酶)的编辑效率(即在目标靶点上进行切割从而产生双链断裂的效率)和脱靶位点的方法，这也是本领域已知第一种能够同时实现以上目的的方法，在本发明中该方法也被称为PEM-seq法，该方法可以广泛的用于基因组编辑的评估。具体而言，

在本发明的第一个方面中，公开了一种检测双链断裂(DSB)产生试剂的活性的方法，所述双链断裂产生试剂能够在基因组的目标位置处产生双链断裂，包括：

(1)使所述试剂与样品接触以在其基因组中发生双链断裂(DSB)事件；

(2)以步骤(1)经处理的基因组核酸为模板，利用与所述目标位置旁侧序列互补的延伸引物，进行延伸反应以获得序列延伸超过目标位置的延伸产物；

(3)使所述延伸产物在延伸末端连接桥接接头，其中所述桥接接头包含一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)长度为n个核苷酸的随机核酸区段，其中n为1-30或更多，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；使得每条延伸产物通过连接所述桥接接头获得由所述随机核酸区段赋予的独特身份标识(unique identifer)；和