[发明专利]一种检测双链断裂产生试剂活性的方法

权利要求书

1.一种检测双链断裂（DSB）产生试剂的活性的方法，所述双链断裂产生试剂能够在基因组的目标位置处产生双链断裂，包括：

（1）使所述试剂与样品接触以在其基因组中发生双链断裂（DSB）事件；

（2）以步骤（1）经处理的基因组核酸为模板，加入与所述目标位置旁侧序列互补的延伸引物，所述延伸引物为单条引物，通过退火结合于所述双链断裂产生试剂造成的DSB位点的上游或者下游，所述延伸引物与样品基因组进行一次或更多次变性-退火循环，然后进行一次延伸反应以获得序列延伸超过目标位置的延伸产物；

（3）使所述延伸产物在延伸末端连接桥接接头，其中所述桥接接头包含一个或更多个长度为n个核苷酸的随机核酸区段，其中n为1-30或更多；使得每条延伸产物通过连接所述桥接接头获得由所述随机核酸区段赋予的独特身份标识（unique identifier）；和

（4）将步骤（3）所得延伸产物与桥接接头的连接产物进行高通量测序，识别是否在目标位置处发生双链断裂事件和/或在非目标位置处发生的双链断裂事件。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂为工程核酸酶（engineered nuclease）。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述工程核酸酶选自锌指核酸酶（ZFN）、TALEN或者CRISPR-CAS。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是真核细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（2）中，在发生延伸反应之前，所述延伸引物与样品基因组进行1次-20次变性-退火循环。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述延伸引物带有亲和标签（affinity tag）。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述延伸引物5’端连接有生物素（biotin）。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（1）后，还包括对基因组进行片段化的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中对基因组进行片段化的步骤为超声处理或者内切酶消化。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（2）中，所述延伸引物与基因组核酸的结合位点位于目标位置的双链断裂上游或下游2kb以内。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（2）获得延伸产物后，还包括分离延伸产物的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述延伸引物带有亲和标签，所述分离是利用延伸引物的亲和标签通过亲和纯化进行的。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性是指所述试剂的切割效率和/或特异性；或者，在所述测序后还包括根据测序结果分析所述试剂的切割效率和/或特异性的步骤。

14.一种筛选基因组双链断裂位点的方法，其包括

（1）分析目标基因组序列获得双链断裂候选靶位点；

（2）利用双链断裂产生试剂在步骤（1）中的候选靶位点处制造双链断裂；

（3）进行权利要求1至13中任一项所述的步骤；和

（4）分析不同候选靶位点处所述试剂的切割效率和/或特异性。

15.一种筛选工程核酸酶的方法，其包括：

（1）提供工程核酸酶候选物；和

（2）利用权利要求1至13中任一项所述的方法检测所述工程核酸酶候选物的活性，所述活性包括切割效率和/或特异性。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述工程核酸酶是Cas核酸酶。