[发明专利]一种毛细血管畸形相关多基因的捕获测序方法

说明书

本发明公开了一种毛细血管畸形相关多基因的捕获测序方法，该方法至少包括如下步骤：基因组DNA的提取和片段化，片段化DNA末端补平、接头连接、捕获前PCR、杂交捕获、捕获后PCR。本发明选取的与人毛细管畸形相关的多个基因，包括ACVRL1、AKT1、ENG、EPHB4、GNA11、GNAQ、KRAS、MAP2K1、NRAS、PIK3CA、PTEN、RASA1、SMAD4、TEK，通过将基因捕获技术与高通量测序技术相结合，从而检测靶基因的所有变异类型，如突变、缺失、插入、融合等。

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种毛细血管畸形相关多基因的捕获测序方法。

背景技术

毛细血管畸形为新生儿易患疾病，其中包括多个亚型，仅葡萄酒色斑（鲜红斑痣）罹患率就高达千分之三，而这些疾病跟基因突变有着密不可分的关系。在《血管瘤和脉管畸形诊断和治疗指南（2016版）》中明确提出多个分型跟基因突变的关系。其中与动静脉畸形相关的基因多达十几个，且存在临床诊断、用药选择困难。

为解决以上问题，我们通过基因捕获的高通量测序方法将很好的解决此类问题。

目标序列的富集可以通过两种策略来实现：捕获或扩增。目前的许多技术大多是采用这两种模式，有时是将它们相结合。

捕获法通常是从NGS的文库制备开始的，比如打断DNA，将接头与片段连接，并开展PCR扩增。之后，使用与感兴趣的片段互补的生物素化探针，让其与DNA杂交，再用链霉亲和素筛出。通过第二轮PCR释放互补链，然后就可以测序了。

目标序列的富集也可以利用多重PCR的策略来开展，这称为扩增子方法。将DNA酶切消化，利用探针来捕获两端以形成环状的DNA模板，或使用基因组或随机剪切的DNA模板。之后，利用特异性引物来扩增感兴趣的DNA区域，形成高度富集的DNA库。

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generationsequencing，NGS)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。

通过将基因捕获技术与高通量测序技术相结合，我们可以对毛细血管畸形相关的14个基因进行全面的突变评估。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种多探针富集毛细血管畸形相关14个基因靶区域的方法，通过设计专用的捕获探针库，采用探针捕获技术一次性富集多个基因多靶点序列，从而实现多基因多靶点并行深度高通量测序。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于多探针富集14个基因靶区域的方法，包括如下步骤。

S1 基因组DNA的提取和片段化。

1.1 准备试剂如下：QIAamp DNAMini试剂盒。

1.2 基因组DNA的提取，用QIAamp DNAMini试剂盒对被检者进行组织提取，被检者组织的取材应取自表皮以下的真皮层，包含毛细血管为宜。

1.3 基因组DNA片段化，使用Covaris仪器，并按推荐操作流程进行操作，目标片段大小为200-300bp。

S2 片段化DNA末端补平。

2.1 准备试剂如下：End prep mix4。

2.2 配制反应体系：在PCR管中加入DNA和End prep mix4，配制完成后，涡旋并短暂离心。

2.3 将配制完成的反应体系置于PCR仪上，启动反应程序。