[发明专利]一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用，该构建方法包括：步骤一、根据基因组DNA序列分别设计上游引物和下游引物；步骤二、在每条上游引物上添加A接头和第一标签，得到上游融合引物，在每条下游引物上添加P接头和第二标签，得到下游融合引物，并将上游融合引物与下游融合引物混合得到混合融合引物；步骤三、将混合融合引物、基因组DNA、含有Mg²⁺，dNTPs，Taq酶的Tris‑HCl缓冲液和无核酸酶水配制成多重PCR反应体系；步骤四、将得到的多重PCR反应体系进行PCR反应、纯化得到多样品测序文库；本发明构建方法通过上下游引物上不同标签组合识别样品，能够大大降低引物合成量，此外，还能够减少扩增次数，有效降低样品间的数据不均衡。

技术领域

本发明涉及生物医学、法医学、刑侦及物证鉴定技术领域，具体涉及一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

高通量测序技术自2010年以来发展迅猛，由于该技术可获得的数据量较大，针对不同的项目需求，可满足几十甚至几百份样品的位点分型要求。为了区分样品，在构建文库时，每个样品的序列前添加了样品标签(barcode)，在进行数据分析时利用识别序列将测序数据分到每个样品中。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。目前，基于高通量测序技术检测人基因组单核苷酸多态性中，测序数据的归类均是通过单个样品标签进行识别；对于同时检测几十份样品的上百个靶标的核酸序列，使用单个样品标签进行识别分类，容易造成样品间数据量相差悬殊且引物合成成本较高；此外，引物处理繁琐，易出错，且对引物间的扩增不均衡不宜进行调整。

发明内容

为此，本发明提供一种检测多个样品时测序文库的构建方法，用于解决现有技术中由于测序数据的归类通过单个标签进行识别容易导致的各样品间数据量相差悬殊，引物合成成本较高且引物处理繁琐，易出错，对引物间的扩增不均衡不宜进行调整的问题。

为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：

在本发明的实施方式的第一方面中，提供了一种检测多个样品时测序文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

步骤一、根据基因组DNA序列分别设计上游引物和下游引物；

步骤二、在每条上游引物上添加A接头和第一标签，得到上游融合引物，在每条下游引物上添加P接头和第二标签，得到下游融合引物，并将上游融合引物与下游融合引物混合得到混合融合引物；

步骤三、将混合融合引物、基因组DNA、含有Mg²⁺，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液和无核酸酶水配制成多重PCR反应体系；

步骤四、将得到的多重PCR反应体系进行PCR反应、纯化得到多样品测序文库。

本发明上述构建方法，在上游引物和下游引物的5’端分别依次增加标签序列和接头序列，并合成融合引物，其中上下游引物采用不同标签序列，即能够通过含不同序列的第一标签与不同序列的第二标签任意组合以识别样品，进而能够大大降低引物合成量；此外，采用双样品标签融合引物法相较于连接法，减少了扩增次数，有效降低样品间的数据不均衡。

进一步地，所述第一标签和第二标签的序列不同，且分别为1-20核苷酸或类核苷酸的随机序列。

进一步地，所述步骤四中，纯化采用的方法为：吸取20μL PCR产物到一个1.5mL EP管中，再加入30μL磁珠，吸打混匀，室温下平衡5分钟；将混合物放在磁力架上，移除上清液后，用70％乙醇清洗磁珠两次，加入20μL水洗脱，洗脱液即为构建完成的文库。

在本发明的一个实施例中，所述A接头或P接头选自Ion PGM、Ion Proton或IonS5/S5XL测序平台的接头。