[发明专利]一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201910056472.1 | 申请日： | 2019-01-18 |
| 公开（公告）号： | CN109797437A | 公开（公告）日： | 2019-05-24 |
| 发明（设计）人： | 周骋 | 申请（专利权）人： | 北京爱普益生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 北京知呱呱知识产权代理有限公司 11577 | 代理人： | 孙进华;吴林 |
| 地址： | 100176 北京市大兴区*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 融合引物 构建 测序文库 多重PCR反应 上游引物 下游引物 种检测 标签 基因组DNA序列 无核酸酶水 基因组DNA 标签组合 引物合成 上游 不均衡 多样品 缓冲液 扩增 引物 应用 | ||
1.一种检测多个样品时测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、根据基因组DNA序列分别设计上游引物和下游引物；
步骤二、在每条上游引物上添加A接头和第一标签，得到上游融合引物，在每条下游引物上添加P接头和第二标签，得到下游融合引物，并将上游融合引物与下游融合引物混合得到混合融合引物；
步骤三、将混合融合引物、基因组DNA、含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液和无核酸酶水配制成多重PCR反应体系；
步骤四、将得到的多重PCR反应体系进行PCR反应、纯化得到多样品测序文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一标签和第二标签的序列不同，且分别为1-20核苷酸或类核苷酸的随机序列。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述A接头或P接头选自Ion PGM、IonProton或Ion S5/S5XL测序平台的接头。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，所述添加方法为在上游引物序列的5’端依次添加第一标签序列、A接头序列组成一段长度为46-80碱基的核苷酸序列，在下游引物序列的5’端依次添加第二标签序列、P接头序列组成一段长度为40-80碱基的核苷酸序列，随后，分别合成上游融合引物和下游融合引物。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述混合融合引物中每对引物浓度为0.1-3.0μM。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因组DNA浓度为0.1-100ng/μL。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为5-30mM；Mg2+浓度为1-20mM；dNTPs浓度为0.1-2mM；Taq酶浓度为0.1-5U。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，多重PCR反应体系中各原料的体积份数为：含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液2.8-3.2份、混合融合引物0.1-0.3份、基因组DNA0.8-1.2份和无核酸酶水5.5-6.1份。
9.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：93-96℃1min；93-96℃30s，50-63℃30s，68-72℃1min，共10-25个循环；随后，在10℃下保存。
10.权利要求1-9任一所述的构建方法在人基因组单核苷酸多态性检测中的应用。
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