[发明专利]基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法及其应用，该方法包括如下步骤：提取样本基因组用于PCR反应；(2)设计至少包含一个的PCR引物、并用α‑硫代脱氧腺苷三磷酸替代脱氧腺苷三磷酸进行PCR扩增；(3)分析PCR扩增产物中焦磷酸；(4)根据分析结果判定PCR反应是否发生，检测出样本中含有待测的DNA含量。本发明方法可以准确的检测出样本中是否含有样本DNA及其含量、其检测限可达数个拷贝；该检测分析方法灵敏度高，检测快，操作流程简单容易实施，能对大样本特异PCR产物实施快速检测，可用于食品、卫生等行业的微生物的快速检测，也可以用于其它具有特异PCR反应的核酸序列分析。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法及其应用，适用于食品安全、饮用水安全监测、临床样本等特定DNA片段的快速分析与鉴定。

背景技术

PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA大幅增加，通过简单电泳等快速的方法分析，则可以通过电泳条带清晰判断PCR反应是否发生、判断样本中是否存在特定的DNA片段。这种PCR技术在分析诸如单核苷酸变化(SNP、突变、插入、七失)分析(如滚环扩增)，致病性微生物(如:沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、志贺氏菌、禽流感病毒、黄曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等)等检测中得到广泛应用。然而，在现有基于PCR的检测技术中，所有分析的对象均为PCR反应中产生的DNA序列，其理论量为样本中核酸拷贝数的2^N-1(N为PCR循环数)，如果采用电泳等简单、快速的方法分析，则样本中核酸拷贝数目需要达到数百个才能通过电泳条带清晰判断PCR反应是否发生，对低丰度样本无法实施有效检测。如在低拷贝数引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物需要采用传统的培养法检测，其操作步骤繁琐、耗时长，不能满足快速检测于诊断的需求。

实际上，在PCR过程中，每合成一个核苷酸、PCR引物便会延伸一个碱基长度，同时也会伴随产生一个副产物焦磷酸分子。假定样本中存在一个DNA分子，如果每条一条引物在PCR过程中延伸100个碱基，在一对DNA模板在一个PCR过程要产生200个焦磷酸分子；也就是说PCR过程中，产生的焦磷酸分子数目一般为DNA的几百倍。因此，通过几十个循环的PCR反应，其焦磷酸的理论量可以达到10^-11摩尔(如PCR进行36个循环，则合成100个碱基的PCR产物产生的焦磷酸量为(2×100×2³⁵)/(6×10²³)＝1.1×10^-11摩尔；其浓度可以达到1.1×10^-11摩尔/25μL＝0.4mM)，足以达到一般化学发光分析的10^-12克检测限。因此，选择分析PCR副产物焦磷酸，而非PCR产物DNA片段其灵敏度更大，更适合低丰度核酸序列的分析。

现有非常多的分析方法用于焦磷酸的定量分析技术，应用焦磷酸分析的一个典型例子为焦测序。其原理是反应底物为5'-磷酰硫酸、荧光素，在腺嘌呤核苷三磷酸硫酸化酶的作用下，焦磷酸可以和5'-磷酰硫酸结合形成腺嘌呤核苷三磷酸，在荧光素酶的催化下，生成的腺嘌呤核苷三磷酸又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过检测装置可获得一个检测峰，峰值的高低和焦磷酸的量成正比。