[发明专利]基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样本基因组，基因组用于PCR反应；

(2)设计至少包含一个的PCR引物、并用α-硫代脱氧腺苷三磷酸替代脱氧腺苷三磷酸进行PCR扩增；

(3)分析步骤(2)PCR扩增中副产物焦磷酸；

(4)根据分析结果判定PCR反应是否发生，以及检测出样本中含有待测的DNA含量。

2.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，所述特异PCR是指引物只扩增特定的核酸序列片段，不扩增其它序列片段。

3.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述基因组直接或者经过处理后用于PCR反应，所述经过处理是指基因组通过酶切、成环反应。

4.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，步骤(2)所述设计至少包含一个的PCR引物是针对基因组中特定的核酸序列片段或者针对人工合成的序列片段进行设计，所述特定的核酸序列片段是指某种生物的唯一具有、其它生物中不具有、并且通过公用数据库可以获得的核酸序列信息；所述人工合成的序列片段是指通过对生物基因组者经过处理后、构建用于滚环扩增或者等温多自配引发扩增的新DNA模板。

5.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增包括单、双或多引物的等温或变温PCR。

6.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，步骤(2)所述用α-硫代脱氧腺苷三磷酸替代脱氧腺苷三磷酸进行PCR扩增为用α-硫代脱氧腺苷三磷酸dATPαS替代脱氧腺苷三磷酸dATP，其余三种核苷酸单体为常规dNTPs进行即dGTP、dTTP和dCTP。

7.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，步骤(3)所述分析PCR扩增副产物中焦磷酸优选为通过焦磷酸化学发光分析，直接分析PCR产物中的焦磷酸来实现的。

8.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，步骤(4)中所述根据分析结果判定PCR反应是否发生，是通过设定的焦磷酸分析的CV值来判断：焦磷酸分析信号强度大于CV值判定为有、与之对应为样本中是含有待测的DNA；小于CV值判定为无、与之对应为样本中是不含待测DNA。

9.根据权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述检测出样本中含有待测的DNA含量是指先通过一系列已知浓度DNA模板经过步骤(1)—(4)，建立浓度与信号强度的关系曲线后，再分析样本得到的信号强度，从关系曲线上求得该DNA具体浓度。

10.一种权利要求1所述的基于分析PCR副产物焦磷酸的特异PCR产物快速检测方法在食品安全、饮用水安全监测、临床样本特定DNA片段的快速鉴定中的应用。