[发明专利]偶联到单一支持物或标签的线性双链DNA和用于制备所述线性双链DNA的方法

说明书

本发明涉及线性双链DNA，其在其非编码链的3'末端偶联到单个支持物或标签，以及制备所述线性双链DNA的方法。本发明还涉及所述线性双链DNA在RNA体外转录反应中的用途，并且还涉及体外制备RNA的方法。本发明还涉及用于RNA体外转录的生物反应器。

技术领域

本发明涉及一种线性双链DNA，其包含编码序列元件，所述编码序列元件在其非编码链的3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。

本发明还涉及一种用于制备上述线性双链DNA的方法。几种方法包括将修饰的脱氧核苷酸添加到线性双链DNA的3'末端并将所述修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签的步骤。通过核酸内切酶消化所获得的线性双链DNA导致线性双链DNA，其仅在其非编码链的3'末端包含支持物或标签。另一种方法包括向线性双链DNA的每条链的3'末端添加连接了标签的脱氧核苷酸，然后进行核酸内切酶酶切，以获得在非编码链的3'末端带有单个标签的线性双链DNA。还有一种方法包括在具有平端和粘端的线性双链DNA的平端特异性地向所述非编码链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸，并且还包括经由所述经修饰的脱氧核苷酸将所述DNA偶联到支持物或标签。还可以用连接了标签的脱氧核苷酸获得上述非编码链的3'末端的特异性添加。本发明提供了包含用于执行上述方法的必要组分的试剂盒。

包含编码序列元件和在其非编码链的3'末端的支持物或标签的线性双链DNA用于RNA体外转录的用途也是本发明的一部分。此外，本发明还提供了一种体外制备RNA的方法，包括提供如上所述的双链线性DNA作为模板DNA是本发明的一部分。另外，本发明涉及一种用于RNA体外转录的生物反应器，其包含如上所述的线性双链DNA。

背景技术

基于RNA的疗法是现代医药的最有前景和快速发展的领域之一，因此核糖核酸分子(RNA)代表了一类新兴药物。基于RNA的疗法为各种疾病的治疗提供高度特异性和单独的治疗选项，并且可以例如用于免疫治疗、基因治疗和遗传疫苗接种。因此，需要以合理的价格制备大量的高品质RNA。

通常，RNA是使用合适的DNA模板通过RNA体外转录反应产生的。为了获得适用于基于RNA的治疗剂的均质RNA，RNA必须具有独特的长度，这是通过在体外转录反应中精确终止RNA来实现的。控制RNA体外转录终止的常见方式是在RNA编码序列之后立刻对DNA模板进行线性化。这样就实现了所谓的失控(run-off)RNA体外转录。

为了获得适合在治疗中使用的高级RNA，必须进行各种质量控制步骤，例如确保DNA模板的正确线性化，以及随后通过DNA消化和随后的RNA纯化从RNA产物中除去DNA模板。

因此，RNA制备中的一个关键步骤是生成合适的DNA模板，这在工业规模是主要的成本因素。然而，目前，DNA模板通常只能用于单次RNA体外转录反应，随后需要通过DNAse消化而被破坏并且通过RNA纯化去除，以确保基于RNA的治疗剂的功效和安全性。在最终的基于RNA的治疗剂中残留量的DNA可能会诱导先天免疫系统的激活，并且具有在患者中充当致癌基因的可能。

因此，需要提供一种可再次使用的DNA模板，它在没有破坏的情况下可以容易且有效地从RNA体外转录反应分离。