[发明专利]偶联到单一支持物或标签的线性双链DNA和用于制备所述线性双链DNA的方法在审
| 申请号： | 201880082819.3 | 申请日： | 2018-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN111511928A | 公开（公告）日： | 2020-08-07 |
| 发明（设计）人： | 本雅明·亚兹丹·潘纳;蒂尔曼·鲁斯;薇罗妮卡·瓦格纳;卡罗拉·波格拉茨 | 申请（专利权）人： | 库瑞瓦格股份公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6865 | 分类号： | C12Q1/6865;C12P19/34 |
| 代理公司： | 北京市隆安律师事务所 11323 | 代理人： | 权鲜枝;赵喆 |
| 地址： | 德国*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 偶联到 单一 支持 标签 线性 dna 用于 制备 方法 | ||
1.一种包含编码链和非编码链的线性双链DNA，其中所述DNA包含(i)由所述编码链在该编码链的5'至3'的方向上编码的编码序列元件，以及(ii)所述编码序列元件上游的RNA聚合酶启动子序列元件，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，并且其中所述支持物或标签是偶联到所述DNA的唯一支持物或标签。
2.根据权利要求1所述的线性双链DNA，其中所述非编码链通过三唑在其3'末端偶联到支持物或标签。
3.根据权利要求1或2所述的线性双链DNA，其中所述标签为生物素。
4.根据权利要求3所述的线性双链DNA，其中所述生物素与链霉亲和素，优选链霉亲和素包被的微珠，最优选链霉亲和素包被的磁性微珠相关联。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的线性双链DNA，其中所述编码序列元件侧翼为5'UTR和/或3'UTR元件。
6.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)温育在步骤(b)中获得的DNA与识别所述酶切位点元件的限制性内切酶，以获得在所述非编码链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(d)将步骤(c)中获得的DNA通过其经修饰的脱氧核苷酸与支持物或标签偶联，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
7.一种用于制备线性双链DNA的方法，所述线性双链DNA包含编码链和非编码链，其中所述非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含编码序列元件的线性双链DNA，所述编码序列元件由所述编码链编码，在所述3'末端随后为酶切位点元件；
(b)温育所述DNA与(i)经修饰的脱氧核苷酸和(ii)能够在链的3'末端添加所述经修饰的脱氧核苷酸的酶，以提供在每条链的3'末端具有经修饰的脱氧核苷酸的线性双链DNA；
(c)将步骤(b)中获得的DNA通过在每条链的所述3'末端的所述经修饰的脱氧核苷酸偶联到支持物或标签；
(d)将步骤(c)中获得的DNA与识别所述酶切元件的限制性内切酶温育，以提供线性双链DNA，其中所述DNA的非编码链在其3'末端偶联到支持物或标签。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述经修饰的脱氧核苷酸选自由炔脱氧核苷酸、叠氮化物脱氧核苷酸、氮杂二苯并环辛炔脱氧核苷酸、反式-环辛烯脱氧核苷酸和乙烯基脱氧核苷酸组成的组。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中能够在链的3'末端添加经修饰的脱氧核苷酸的酶是DNA聚合酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶选自由水生栖热菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、酿酒酵母DP1DNA聚合酶、哺乳动物DNAβ聚合酶、工程化DNA聚合酶、DNA聚合酶I大(Klenow)片段和末端转移酶组成的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述DNA聚合酶是水生栖热菌DNA聚合酶，并且其中在步骤(a)中提供的线性化DNA包括在所述编码序列元件的5'末端的平端。
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