[发明专利]具有增强的蛋白质表达的因子VⅢ突变体表达载体

说明书

本公开涉及携带编码凝血因子VIII突变体的多核苷酸并增加蛋白质表达的表达载体，以及包含该表达载体的用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物。本公开的因子VIII突变体是通过在因子VIII中缺失一部分B结构域(残基784至1667)和一部分a3区域(残基1668至1671)而得到的，其结果是携带编码因子VIII突变体的多核苷酸的表达载体的蛋白质表达能力显著增加。

技术领域

本公开涉及一种表达载体，其包含编码凝血因子VIII突变体的多核苷酸并具有增加的蛋白质表达，以及包含该表达载体的用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物。

背景技术

血友病A(HA)是一种严重的遗传疾病。血友病是一种与X染色体上的基因有关的疾病，每5000名男性中有1名出现血友病。它是由血浆糖蛋白因子VIII(FVIII)的变化引起的，该因子是血液凝固过程中的重要组成部分。因子VIII(以下称为FVIII)编码2351个氨基酸，并具有六个结构域(A1-A2-B-A3-C1-C2)。异二聚体由包含A1、A2和B结构域的重链和包含A3、C1和C2结构域的轻链形成。

在1980年代之前，血友病患者接受从他人血浆中提取的因子VIII用于治疗。但是，该方法存在严重的问题，例如病毒感染。自1980年代以来，为了解决该问题，一直使用通过重组蛋白技术在CHO细胞等中产生的全长因子VIII。后来，众所周知，B结构域缺失的因子VIII(F8-BDD)能够以高蛋白生产率生产而没有活性差异，这种基于双链F8-BDD的重组蛋白(分别表达重链和轻链)已被开发和使用。与双链F8-BDD相比，由于其优异的体内稳定性，最近开发的截短的单链F8-BDD重组蛋白被证明显示出AUC增加2倍至4倍。

尽管因子VIII重组蛋白显示出优异的治疗效果，但为了防止血友病患者内部出血，它在体内的浓度应始终保持在5％或高于5％。为此，应每天或每周2次至3次施用蛋白质。为了克服该缺点，在2000年代早期开发了基于重组病毒的基因治疗剂。基于重组病毒的基因治疗剂使用大小小于4.4kb的B结构域缺失的因子VIII(以下称为“F8-BDD”)，而不是大小为7kb或大于7kb的全长因子VIII。特别地，大多数治疗剂使用单链F8-BDD基因而不是双链F8-BDD基因。

本公开的发明人已努力开发具有进一步改善的稳定性的因子VIII基因治疗剂。为此，开发了与单链F8-BDD基因相比在真核细胞中表现出改善的稳定性和增加的蛋白质表达的单链F8-BDD突变体，以及表达该突变体的表达载体。此外，已经确定，通过使用内源性启动子，例如延伸因子-1α(EF-1α)和密码子优化(CO)单链F8-BDD突变体可以进一步改善表达和稳定性，并完成了本公开。

[相关技术的参考]

[专利文件]

(专利文件001)KR 10-1542752 B。

公开

技术问题

本公开涉及提供具有增加的蛋白质表达的因子VIII突变体表达载体。

本公开还涉及提供用于预防或治疗出血性疾病或出血的药物组合物，其包含表达载体。

技术方案

本公开提供了包含编码因子VIII突变体的单链多核苷酸的因子VIII突变体表达载体，其中氨基酸Asp784至Arg1671从由SEQ ID NO 1表示的因子VIII中缺失。

在本公开的示例性实施方案中，因子VIII突变体可以具有由SEQ ID NO 3表示的氨基酸序列。

在本公开的示例性实施方案中，载体可以选自pCDNA3.1、pGP和pEF。