[发明专利]一种线粒体基因组测序引物、试剂盒及方法

说明书

本发明涉及线粒体疾病诊断及测序领域，具体而言，涉及一种线粒体基因组测序引物、试剂盒及方法。本发明所提供的引物、试剂盒结合三代测序方法，可有效对人线粒体基因组进行测序，并对其中的突变进行分析。

技术领域

本发明涉及线粒体疾病诊断及测序领域，具体而言，涉及一种线粒体基因组测序引物、试剂盒及方法。

背景技术

Anderson等于1981年测定了人线粒体基因组全序列，共16569bp，与细胞核DNA相比，mtDNA作为生物体种系发生的“分子钟”(molecular clock)有其自身的优点：①突变率高，是核DNA的10倍左右，因此即使是在近期内趋异的物种之间也会很快地积累大量的核苷酸置换，可以进行比较分析；②mtDNA是母性遗传，且不发生DNA重组，因此，具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先人线粒体DNA(mtDNA)，共包含37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸(tRNA)、2个编码核糖体核糖核酸(12S和16S rRNA)，13个编码多肽。线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为power house。线粒体DNA突变与许多人类疾病相关，线粒体疾病的发生是由于线粒体的功能不正常而导致的一些疾病，这种突变会影响的大多数是能量需求高的器官，例如肌肉、大脑、心脏，所以检测线粒体基因的突变尤为重要，线粒体基因组的分析测定需要对37个基因进行分析，由于线粒体基因属于母系遗传，母亲的产前线粒体基因组分析对于生育健康宝宝具有重大意义。对于可疑线粒体病的患者来说，理想的遗传学诊断方法是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。这些基因突变可能在mtDNA上，也可能发生在核基因上，线粒体的遗传方式可能为常染色体隐形遗传、X-连锁遗传、母系遗传，有些还是新突变。由于线粒体病涉及基因众多，目前临床只能选择少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。

线粒体基因组的分析测定需要对37个基因进行分析，由于线粒体基因属于母系遗传，母亲的产前线粒体基因组分析对于生育健康宝宝具有重大意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种引物对组合产品，其包括下列引物对：

SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6。

上述引物对可对人线粒体基因组(mtDNA)进行分段扩增，扩增产物能够覆盖mtDNA全长，且三对引物的PCR产物间有重叠，可以确保引物位置处若发生突变或结构变异亦可检测到。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对组合产品。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种线粒体基因组测序方法，包括：

a)制备如上所述的组合物；以及

b)对所述组合物中的扩增子的两端连接用于区分不同样品的barcode序列以构建三代测序的文库模型并上机测序；

c)可选的，对测序结果的序列拼接。

本发明还涉及上述产品及方法在检测人线粒体基因变异以及制备人线粒体缺陷相关疾病的诊断剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

a)操作简便快速，低起始模板量，线粒体全长可覆盖。反应数变少，所以在可有效检测线粒体全长的时候，对样品的起始量要求更低了，对模板纯度及完整性要求也降低了。

b)检测敏感性，低频突变可以被检测到，可以检测已知突变位点同时也可发现一些未知突变。是由PCR反应使得拷贝数很低的低频突变也能被放大，从而检测出这些突变，三对引物的PCR产物间有重叠，可以确保引物位置处若发生突变或结构变异亦可检测到。