[发明专利]一种增加多重PCR引物兼容性的方法

说明书

本发明公开了一种增加多重PCR引物兼容性的方法，属于生物检测领域。本发明针对每个靶基因设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增；最后根据检测平台采取探针杂交或非探针杂交方式进行检测。此方法通过控制每一步PCR扩增使用的各反应组分浓度，如引物浓度、Mg²⁺浓度等，控制PCR扩增的反应条件，如：退火温度、退火时间等来实现多靶标基因的特异、灵敏扩增。本发明特异性强，可以保证不同病原体核酸的扩增效率相似，避免了传统多重PCR扩增的偏斜性；在进行检测时就不需要进行变性以解链。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种增加多重PCR引物兼容性的方法。

背景技术

分子诊断市场是以PCR(聚合酶链式反应)技术为唯一基础的技术延伸，这项诺贝尔获奖技术为生物诊断技术领域做出了革命性的贡献。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。但在这项革命性的诊断技术应用在临床检测过程中，大多基于PCR技术开发的分子诊断产品只能使用一对引物扩增一个DNA靶点，也就是说：一种试剂盒只能检测一个指标。这样使得PCR检测技术的开发应用进入了瓶颈。

很多感染类疾病病原体众多，比如每年夏季流行的儿童手足口病，手足口病是由肠道病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征的一种急性常见传染病。引起手足口病的病原体主要为肠道属的柯萨奇病毒A组的2、4、5、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。不同型别肠道病毒感染导致的手足口病情也各不相同。与其他肠道病毒相比，EV71型引起的手足口病重症感染的比例较大，重症患儿病死率可达10％至25％。在对这类疾病病原体进行鉴别检测时，若应用普通PCR技术需要进行多轮检测，操作繁复，耗时较长，不能满足社会要求，尤其是在疾病爆发期，需要检测的样本众多，该方法更显得效率低下。因此，我们需要更加快速、高效的检测方法。于是众多的生物技术公司将研发的重点投向了多重PCR技术，即通过一次检测过程可以实现多个指标的检测。

在传统的多重扩增方法中，用多对引物同时扩增多条靶序列是有问题的，因为每条不同的靶序列都具有各自的最佳扩增条件，很难将其统一，即便统一，每条靶序列也存在扩增效率不同，从而导致低浓度/滴度病原体不被扩增，不被检测，而出现假阴性结果。此外，经标记的引物在高浓度使用时容易产生二聚体，从而在扩增结果中造成高的背景。同时，我们还要考虑同时检测不同的扩增子，要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳，要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。

授权公告号为“CN 1898395 B”申请号为200480037162.7的中国发明专利公开了基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒，其说明书公开了一种多重扩增的方法，该方法针对每一个靶基因设计两对特异性引物(一对内引物、一对外引物)和一对通用引物，其中内引物5’端带有通用引物，类似于巢式PCR。扩增时将所有引物全部加入到反应体系中，通过降低内引物、外引物的使用浓度，增加退火时间来进行扩增。

上述方法存在如下缺陷：

1、引物设计难度较大。上述多重扩增方法针对每个靶基因都需要设计两对特异性引物，那么进行三重PCR扩增就需要设计六对特异性引物，以此类推。这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，设计难度加大。尤其对于某些基因来说，同源性较低，引物设计难度更大。

2、易导致扩增偏斜性。运用该方法进行扩增时将所有引物全部加入到反应体系中，引物间相互干扰较大，同时资源竞争更加激烈，更容易导致扩增偏斜性。

3、扩增时间长。该扩增方法的内引物、外引物使用浓度很低，这也就需要增加退火时间以保证其有效的特异性结合，这也就导致了扩增时间的延长。通常进行这样一个完整的PCR扩增需要4.5-5个小时。