[发明专利]一种增加多重PCR引物兼容性的方法

权利要求书

1.一种增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：针对每个靶基因设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增。

2.如权利要求1所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：每个特异性引物Fs、Rs的5’ 端都带有通用引物Fg、Rg标签。

3.如权利要求1所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：所有特异性引物Fs、Rs的5’ 端所带的通用引物Fg、Rg的核酸序列均相同。

4.如权利要求1或2所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：特异性引物Fs、Rs的长度为20-25bp。

5.如权利要求1或2所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：通用引物Fg、Rg的长度为15-20bp。

6.如权利要求5所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：通用引物Fg、Rg与任何已知GenBank中收录的序列都不具有同源性。

7.如权利要求1所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：富集扩增包括两轮扩增过程，富集扩增的第一轮扩增以提取的样本核酸DNA或RNA为模板，特异性引物Fs、Rs与提取的样本核酸模板特异性结合，获得5’端带有通用引物标签的PCR扩增产物；富集扩增的第二轮扩增以第一轮扩增产生的5’端带有通用引物标签的PCR扩增产物为模板，产生5’端、3’端均带有通用引物标签的PCR产物。

8.如权利要求7所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：所述富集扩增的第一轮扩增条件为退火温度55-60℃，退火时间60-120s，进行6-10个循环。

9.如权利要求7所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：所述富集扩增的第二轮扩增条件为退火温度65-70℃，退火时间30-60s，进行10-20个循环。

10.如权利要求7所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：指数扩增以富集扩增纯化后的产物为模板，以退火温度50-55℃、退火时间30-40 s，进行30-40个循环。

11.如权利要求10所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：富集扩增的PCR产物通过凝胶纯化或者磁珠纯化后并回收，回收产物作为指数扩增的模板。

12.如权利要求8或9所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于，富集扩增阶段将针对所有靶基因的带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs全部加入到反应体系中，反应各组分使用浓度如下：每种靶基因正、反向引物Fg+Fs、Rg+Rs的终浓度为0.05-0.15μM，反应体系中正向或者反向引物引物总浓度不高于10 μM； dNTP终浓度为0.3-1.5 mM；Mg²⁺终浓度为2.5-5 mM；Taq DNA聚合酶每50μL反应体系2-10 units。

13.如权利要求10所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于，指数扩增阶段各组分浓度如下：正向通用引物Fg的终浓度为0.1-0.3 μM、反向通用引物Rg的终浓度为0.15-1 μM；dNTP终浓度为0.2-0.5 mM；Mg²⁺终浓度为2-3 mM；Taq DNA聚合酶每50μL反应体系1.25-2 units。

14.如权利要求11所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：富集扩增阶段，正向特异性引物Fg+Fs、反向特异性引物Rg+Rs的使用浓度相等。

15.如权利要求12所述增加多重PCR引物兼容性的方法，其特征在于：指数扩增阶段，反向通用引物Rg的浓度高于正向通用引物Fg的浓度。