[发明专利]荧光原位检测人EGFR基因21号外显子p.L858R突变的方法及试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种荧光原位检测人EGFR基因21号外显子p.L858R突变的方法及试剂盒。方法包括：使用蛋白酶处理体系通透细胞；使用二类限制性内切酶暴露平末端；使用核酸外切酶处理体系；使用探针结合处理体系结合单链DNA；使用连接酶处理体系形成环状DNA；使用乙醇脱水处理体系，固定单链基因组DNA和环状探针DNA；使用聚合酶处理体系在聚合酶的作用下进行大量自我复制，产生60‑70kb左右的含重复序列的单链DNA；使用荧光探针结合处理体系，大量的荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上；本发明提供的试剂盒可以通过特异性的探针，用少量的细胞或者临床组织样本检测突变。

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种荧光原位检测人EGFR基因21号外显子p.L858R突变的方法及试剂盒。

背景技术

近年来，随着分子病理诊断的快速发展。恶性肿瘤的诊断，治疗都有了很明显的进步。肺癌患者尤其受益于分子病理诊断，特别是核酸突变的检测。这其中以人EGFR基因热点突变的检测为代表。

传统的检测方法需要从肿瘤组织提取基因组DNA或者血液中提取游离DNA，再进行PCR检测或者二代测序检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光原位检测人EGFR基因21号外显子p.L858R突变的方法及试剂盒。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种荧光原位检测人EGFR基因21号外显子p.L858R突变的方法，包括下述步骤：

(1)待检测样本固定好后，使用蛋白酶处理体系通透细胞，清洗；

(2)使用二类限制性内切酶处理体系处理细胞基因组DNA，暴露平末端，清洗；

(3)使用核酸外切酶处理体系，从平末端开始沿着5`-3`方向降解单链DNA，保留另一条基因组单链DNA，清洗；

(4)使用探针结合处理体系，荧光探针结合在上一步中保留的基因组单链DNA上，清洗；

(5)使用连接酶处理体系，将探针形成环状DNA，清洗；

(6)使用乙醇脱水处理体系，固定单链基因组DNA和环状探针DNA；

(7)使用聚合酶处理体系，环状探针DNA以单链基因组DNA结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行大量自我复制，产生60-70kb左右的含重复序列的单链DNA，清洗；

(8)使用荧光探针结合处理体系，大量的荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上，清洗；

(9)使用封片处理体系，封片；

(10)最终在荧光显微镜下观察记录结果。

所述的二类限制性内切酶处理体系具体包括：10x CutSmart buffer、10x BSA、PvuII酶和无核酸酶超纯水。

所述核酸外切酶处理体系具体包括：10x CutSmart buffer、10x BSA、甘油、入核酸外切酶和无核酸酶超纯水。

所述蛋白酶处理体系具体包括：0.1N HCl和胃蛋白酶。

所述的探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20x SSC、鲑鱼精子DNA、探针序列5`pho-GCCCAAAATCTGTGATTCCTTTTACGACGCGATCGTAATCACCTACGAGTTCTTCCAGCAGTTTGGCCC-3`和无核酸酶超纯水。

所述连接酶处理体系具体包括：10x T4DNA Ligase buffer、100mM ATP、10x BSA、T4 DNA连接酶和无核酸酶超纯水。