[发明专利]一种启动子组合控制的动态调控系统

说明书

本发明公开了一种启动子组合控制的动态调控系统，具体公开了一种启动子组合控制的涉及动态调控系统及其在莽草酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段，筛选出两类转录特征完全不同的启动子，即生长期关联启动子和稳定期启动子。利用蛋白酶特异性识别切割特定短肽的性质，设计构建出不需要借助人为控制和外源添加诱导剂的蛋白丰度调控系统。通过在工程大肠杆菌中引入靶向莽草酸激酶的动态调控基因线路，实现了在无机盐培养基中，不外源添加芳香族氨基酸和诱导剂生产莽草酸的能力。通过本发明生产的莽草酸产量可达21.2g/L，转化率达0.24g/g葡萄糖。

技术领域

本发明涉及一种启动子组合控制的动态调控系统，具体涉及一种启动子组合控制的涉及动态调控系统及其在莽草酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

动态调控系统是代谢工程领域中新兴的代谢流调控手段，其区别于静态调控的主要特征是在发酵过程中，工程菌株会根据发酵时间，生理状态，胞内代谢物浓度，胞外环境变化做出相应的酶活调整，进而影响代谢流分布，提高产品生产能力。动态调控系统具有发酵过程无需人为调控，不需要外源添加诱导剂的优势，在生产高附加值化合物中具有显著优势。

目前的动态调控系统，主要是依靠群体感应系统进行控制的，即系统的触发器是由本源或者异源的群体感应系统组成。当菌体浓度达到一定浓度时，群体感应系统释放积累的小分子物质会作用于调控系统受体，使调控系统做出相应动作。如2017年，ApoorvGupta等人表于Nature biotechnology的动态系统，该系统由EsaI群体感应系统和靶蛋白C末端添加降解标签组合而成，当菌体浓度达到一定阈值时，靶蛋白的被降解，胞内绝对浓度达到0，从而实现酶活关闭，调控代谢流的目的和效果。该系统具有路径独立特征，并成功应用于肌醇，葡萄糖二酸和莽草酸的生产应用。除此之外，2017年，Xinyuan He等人发表于ACSsynthetic biology的AND逻辑门动态调控系统由群体感应系统和稳定期感应蛋白组成。当菌体浓度达到一定阈值时，启动靶蛋白的转录表达，从而实现代谢流调控目的和效果。该系统运用于PHB生产时，提高了1-2倍PHB产量。综上所述，两种动态调控系统均需要引入异源群体感应系统，然而，异源群体感应系统往往由多个转录调控蛋白组成，它的引入无疑会影响菌株的生长和发酵性能，同时限制了路径酶的表达数量。

为了构建出更为精简的动态调控系统，本发明提出了采用两类能够响应菌株生理状态的启动子组合，并结合蛋白质降解的思路。这两类启动子具有完全不同的转录特征，当菌株处于对数生长期时，生长期关联启动子(简写GPP)的转录活性极强，可以控制目标蛋白的大量转录及合成，而稳定期关联启动子(简写SPP)的转录活性受强烈抑制，不进行蛋白质的转录及合成。当菌株处于稳定期时，生长期关联启动子的转录活性受到抑制，目标蛋白的合成几乎停滞，相反，稳定期关联启动子的转录活性大幅提高，促进了其控制蛋白的转录及合成。在此基础上，组合生长关联启动子负责转录控制的具有N端隐藏降解子的靶蛋白和由稳定期关联启动子负责转录控制的蛋白酶，构建出动态调控基因线路。当菌株处于对数生长期时，靶蛋白能够启动合成，并在胞内积累，行使相应的生理代谢功能。当菌株进入稳定期后，蛋白酶受稳定期关联启动子控制表达，促进靶蛋白隐藏的N端降解子裸露，进而降解靶蛋白，关闭其相应的生理代谢功能。然而，不同的启动子组合时，其转录起始时间存在差异，不同的组合方式调节基因表达的效果不同。

莽草酸是制备抗流感药物达菲的前体药，在大肠杆菌中由分支酸路径合成。传统的生产莽草酸方法是敲除菌株的莽草酸激酶I和II，以阻断莽草酸到莽草酸-3-磷酸的合成通量，实现莽草酸的积累。然而，莽草酸-3-磷酸的下游产物包含大肠杆菌生长必需的芳香族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。直接阻断莽草酸-3-磷酸的合成，将使菌株在无机盐培养基中出现生长缺陷。为了促进菌株生长，现有技术需要在培养基中添加价格昂贵的芳香族氨基酸，或是增加产物分离难度的有机氮源，如胰蛋白胨，酵母粉等。因此，提供一种在简单培养基中高产莽草酸的方法，对于工业制备莽草酸具有重要的意义。

发明内容